溫下法和溫橙法對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠nf和il8表達的影響

溫下法和溫橙法對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠nf和il8表達的影響

潰瘍性胃炎是一種早期和未明確病因的慢性疾病。病變主要表現(xiàn)為結(jié)腸粘膜（直腸和腸道）下炎。以結(jié)腸粘膜下炎癥和潰瘍形成為病理特征，這是早期和早期淋巴結(jié)癌的疾病。臨床以腹瀉、黏液膿血便、腹痛及里急后重為主要癥狀。本病病因未明,治愈難度大,復(fù)發(fā)率高,具有較高的癌變率,被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。本病以慢性復(fù)發(fā)型最為多見,發(fā)作期和緩解期交替出現(xiàn),概屬中醫(yī)“休息痢”范疇?！吨T病源候論》云:“腸胃虛弱,易為冷熱,其邪氣或動或靜,故其痢乍發(fā)乍止,謂之休息痢也?！迸R床根據(jù)潰結(jié)不同時期的病機特點經(jīng)常選用溫下、溫澀之法,取得了較為滿意的臨床療效。而其中“下法”和“澀法”又是中醫(yī)治法中完全相反的兩種概念,如何準確運用、提高治療的針對性是我們課題組研究的重點。本實驗動態(tài)觀察了溫下法和溫澀法代表方溫脾湯和真人養(yǎng)臟湯,對UC模型鼠不同時間點前炎性細胞因子的影響,并探討了其可能作用機制。1材料表面1.1動物清潔級健康雌性SD大鼠,體重為200g～250g。由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供。1.2tnbssiga2,4,6—三硝基本磺酸(TNBS)為Sigma公司產(chǎn)品。血清和結(jié)腸TNF-α、IL-8ELISA試劑盒購自邦定生物技術(shù)公司。1.3動物口服量檢測中藥由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中藥房提供,組方在古文獻記載基礎(chǔ)上略改動。溫脾湯:大黃6g,附子10g,干姜10g,黨參10g,甘草3g。真人養(yǎng)臟湯:黨參10g,當歸10g,炒白術(shù)12g,肉豆蔻12g,肉桂3g,炙干草6g,白芍15g,木香10g,訶子10g,罌粟殼3g。將兩方水煎濃縮,使大鼠每日口服量為成人每公斤體重的8倍,且每只大鼠每日灌喂2.5ml。將柳氮磺胺吡啶片劑研細粉,過120目篩,用蒸餾水配成混懸液,按0.267g/kg(相當于成人每公斤體重的8倍)給藥。2方法2.1tnbs/乙醇液的制備將SD大鼠正常飼養(yǎng)1周后禁食24h(不禁水)。用20%氨基甲酸乙酯(4mL/kg)腹腔麻醉后,將一直徑2mm、長約12cm的橡膠管由大鼠肛門輕緩插入8cm,然后每只推入0.85mLTNBS/乙醇液(TNBS與50%乙醇以體積比12∶5混合)。2.2養(yǎng)臟器湯組模型造模后的日常灌胃1次造模及灌胃1次真養(yǎng)臟器湯組造模后灌胃1次造模后灌胃1次造模的日解反應(yīng)將150只大鼠隨機分為5組,每組30只。正常組每日灌喂1次蒸餾水,模型組造模后每日灌喂1次蒸餾水,柳氮磺胺吡啶組造模后每日灌胃1次柳氮磺胺吡啶混懸液,溫脾湯組造模后每日灌胃1次溫脾湯水煎濃縮液,真人養(yǎng)臟湯組造模后每日灌胃1次真人養(yǎng)臟湯水煎濃縮液。2.3大鼠采血前后10d分別于給藥后1周、2周、4周斷頭處死實驗鼠各10只,采血(采血前禁食24h),靜置2h后,3000r離心10min,取上清,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4血清和腸道tnf-i的測定嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。2.5血清和腸道的il-8試驗嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。3結(jié)果3.1各組血清tnf-含量比較結(jié)果表明,模型組血清TNF-α含量在1周、2周、4周3個時間段均有顯著升高,與正常組比較有顯著差異(P<0.05)。第1周:模型組、柳氮組、真人組血清TNF-α含量明顯高于正常組(P<0.05),而溫脾組其含量明顯低于模型組和真人組(P<0.05)。第2周:柳氮組和溫脾組TNF-α含量降低明顯,與模型組比較有顯著差異(P<0.05),而真人組下降不明顯,與模型組比較無顯著差異(P>0.05);第4周:各治療組與模型組、正常組比較,均無顯著差異(P>0.05,見表1)。3.2各組結(jié)腸tnf-含量比較結(jié)果表明,模型組結(jié)腸TNF-α含量在1周、2周、4周3個時間段均有顯著升高,與正常組比較有顯著差異(P<0.05)。第1周:柳氮組、溫脾組、真人組結(jié)腸TNF-α含量均明顯高于正常組(P<0.05),但柳氮組、溫脾組與模型組相比仍有顯著下降(P<0.05);第2周:柳氮組、溫脾組、真人組TNF-α含量均明顯低于模型組(P<0.05);第4周:柳氮組、真人組TNF-α含量與模型組比較有顯著下降(P<0.05),相反溫脾組下降不明顯,與模型組比較無顯著差異(P>0.05,見表2)。3.3兩組il-8含量的比較結(jié)果表明,UC模型鼠血清IL-8含量在造模1周時表達最高;2周時已有明顯下降,與1周模型組比較有顯著差異(P<0.05),但仍高于正常對照組;4周時與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)。溫脾組在UC1周、2周時間段可以明顯降低異常增高的IL-8含量,與模型組比較有顯著差異(P<0.05);而柳氮組、真人組在UC1周、2周時不能降低IL-8含量,與模型組比較無顯著差異(P>0.05,見表3)。3.4各組小鼠結(jié)腸il-8含量比較隨著病程延長,模型2周、4周組結(jié)腸IL-8含量有明顯下降,與1周模型組比較有顯著差異(P<0.05),但仍高于正常對照組(P<0.05),4周時下降更為明顯,與2周模型組比較有顯著差異(P<0.05)。與正常組比較表明,UC模型鼠結(jié)腸IL-8含量在造模1周時表達最高,4周時比較無顯著差異(P>0.05)。溫脾組在UC1周、2周時間段可以明顯降低異常增高的IL-8含量,與模型組比較有顯著差異(P<0.05);而柳氮組、真人組在UC1周、2周時不能降低IL-8含量,與模型組比較無顯著差異(P>0.05,見表4)。4對小鼠血清tnf-表達的影響TNF-α主要由巨嗜細胞產(chǎn)生,T細胞和NK細胞在某些刺激因子作用下也可分泌TNF-α,其生物活性表現(xiàn)為介導(dǎo)白細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞,首先是中性粒細胞,隨后是單核細胞和淋巴細胞,這些作用導(dǎo)致白細胞在炎癥部位積聚;激活炎性白細胞(尤其是中性粒細胞)殺死某些微生物,對嗜酸性粒細胞和單核細胞也有某些作用;刺激單核細胞及其他種類細胞產(chǎn)生細胞因子,包括IL-1、IL-6、TNF本身及IL-8家族的低分子炎性細胞因子;激活T細胞和刺激B細胞產(chǎn)生抗體;誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞合成集落刺激因子(CSF);抗病毒及殺死或抑制某些腫瘤。目前業(yè)已闡明TNF-α不僅可作為宿主防御、免疫以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程的介質(zhì),而且還是感染、炎癥及損傷的病理因子,在結(jié)腸黏膜損傷及損傷部位的炎癥反應(yīng)中也起到重要作用。TNF-α引起腸黏膜損傷的機制可能是:啟動T、B淋巴細胞活化;在IFN-γ的協(xié)同作用下增強上皮細胞黏附分子、主要組織相容性性抗原Ⅰ和Ⅱ類(MHCⅠ和MHCⅡ)的表達;TNF-α也可以和血管內(nèi)皮細胞上高親和力受體結(jié)合,并通過上調(diào)其黏附分子和趨化性細胞因子IL-8的表達而增加炎癥細胞的聚集;釋放血小板活化因子,生成白三烯和氧自由基、誘導(dǎo)一氧化氮合酶異構(gòu)體,產(chǎn)生大量一氧化氮引起細胞損傷;減少抗凝物質(zhì),激活促凝血機制而促進血栓形成。本實驗結(jié)果顯示,TNBS/乙醇造模潰結(jié)鼠在1、2、4周3個時間段始終處于高水平表達狀態(tài),表明在UC病變過程中TNF-α的作用時刻存在。因此,減少TNF-α的表達或抑制生物學功能在UC防治中具有極其重要的作用,臨床抗TNF-α治療的效果也證明了這一點。本實驗結(jié)果表明,模型鼠血清和結(jié)腸TNF-α水平均有明顯升高。從血清TNF-α表達來看,溫脾組在UC1周時能夠明顯降低血清TNF-α含量,與模型組比較差異明顯;UC2周時溫脾組TNF-α仍然低于模型組,真人組與模型組比較有下降趨勢(P<0.2),但無顯著差異(P>0.05);4周時溫脾組、真人組與模型組、空白組比較均無明顯差異(P>0.05)。結(jié)腸TNF-α表達表明,UC1周時溫脾組結(jié)腸TNF-α含量明顯低于真人組和模型組;第2周時溫脾組、真人組TNF-α含量均有明顯減少;UC4周時真人組TNF-α含量下降明顯,相反溫脾組下降不明顯,與模型組比較無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果可以看出,各治療組在結(jié)腸的TNF-α含量變化較血清TNF-α更為明顯,結(jié)腸的TNF-α測定更能清楚反應(yīng)各治療組用藥效果。這可能與大量炎性細胞主要聚集在腸道病變部位,給予治療藥后能夠首先改變局部炎性細胞浸潤有關(guān)。本實驗說明,溫下法在急性期能夠更好地降低TNF-α含量表達,而在慢性恢復(fù)期溫澀法能更好地減少TNF-α表達。IL-8是一種低分子量蛋白質(zhì),約8Kd,主要由單核細胞、內(nèi)皮細胞、表皮細胞及T淋巴細胞產(chǎn)生,它們在IL-1、TNF和外源性因子脂多糖(LPS)的刺激下產(chǎn)生。IL-8是一種強而有力的中性粒細胞趨化因子和活化因子,主要生物學作用是趨化并激活中性粒細胞,促進中性粒細胞的溶酶體酶活性和吞噬作用,對嗜堿性粒細胞和T細胞也有一定的趨化作用。這些生物學活性與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),故IL-8及相關(guān)的趨化因子在炎癥反應(yīng)中起更直接的介導(dǎo)作用。目前認為,TNF、IL-1、IL-6誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在很大程度上是通過以IL-8為代表的趨化因子所介導(dǎo)的。IL-8陽性表達細胞存在于UC活動期腸黏膜病變區(qū)域,特別是單核細胞及中性粒細胞胞漿內(nèi)、潰瘍底部、黏膜表面的炎性滲出物內(nèi)、隱窩膿腫及瘺管的邊緣。在上皮內(nèi)及固有膜淺層,IL-8陽性細胞可以造成一個梯度,導(dǎo)致中性粒細胞在病損黏膜表面的增加。這種情況處于UC發(fā)病的前期階段。因此在臨床上,IL-8的高水平表達可作為UC復(fù)發(fā)的早期診斷指標,IL-8有可能成為另一個治療目標。動物實驗顯示,抗IL-8抗體對免疫復(fù)合物誘發(fā)的結(jié)腸炎有效。本實驗結(jié)果表明,UC模型鼠血清和結(jié)腸IL-8含量在UC1周時表達最高,2周時已有明顯下降,但仍高于正常對照組,4周時與正常對照組比較無顯著差異。溫脾組在UC1周、2周時間段可以明顯降低異常增高的IL-8含量,而真人組在UC1周、2周時無此作用,IL-8含量仍然很高。說明溫下法在急性期能夠通過降低IL-8表達,減少炎癥反應(yīng);而溫澀法在急性期不能減輕IL-8表達,這也許是溫澀法在急性期療效不佳的又一原因之一。實驗結(jié)果提示,溫下法在急性期可以調(diào)節(jié)致炎性細