荷瘤小鼠證候及其演變的研究

荷瘤小鼠證候及其演變的研究

辨證論治是幾千年來中醫(yī)藥管理經驗和理論的高度概括。“同時疾病和不同的疾病”和“同時疾病和不同的疾病”的治療效果在現代臨床上得到了反復證實。病證結合基礎研究主要采用實驗動物,對于如何判斷實驗動物的證候,尤其是疾病動物的證候,以及評價其療效,以往主要采取三種方式:①以方測證;②微觀辨證(即引用臨床或實驗發(fā)現的與證候有關的實驗室檢測指標);③疾病、證候疊加造模。在取得積極進展的同時,其局限性妨礙了其推廣與應用。長期以來,我們和國內許多學者一再觀察到,疾病大鼠、小鼠存在證候和證候的演變,正常大鼠、小鼠存在體質差異。因此,我們提出基于“四診”的小鼠辨證論治假說[1~2],并開展了多年的探索[3~16],創(chuàng)建了實驗小鼠四診與辨證方法學,以及小鼠四診采集項目、小鼠四診工作站及操作、小鼠常見證候辨證等系列標準[17~19]。最近,我們采用以上方法,在腫瘤的中藥復方療效評價中成功地運用,并有所發(fā)現。1材料和方法1.1實驗動物中心KM品系小鼠120只,雄性,體重17~24g,購自上海復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心,合格證號:KM,SCXK(滬)2002-0002。清潔級條件下常規(guī)飼養(yǎng),腹水傳代肝癌H22細胞右腋下接種0.2ml(含瘤細胞數8×106個)。1.2中藥復方組模擬組接種后第5d選出瘤體大小適中的小鼠90只(其余淘汰),隨機分為10組:正常對照組(甲)、模型對照組(乙)及8個不同中藥復方組,每組10只。中藥復方來自國內公開報道的處方,分別標記為丙、丁、戊、己、庚、辛、壬、癸,并于當天用藥。中藥采用標準水煎醇沉工藝,劑量為正常成人每公斤體重的10倍。每組小鼠每日灌胃0.5ml,正常組及模型組灌等量自來水。常規(guī)飼養(yǎng)。1.3abb/gca的計算標準采集體重、腋溫(℃)、爪和尾顯微數碼拍照(計算機圖像處理,提取反映紅色程度的r值)、晚間35s曠場自主活動計數(跨格數的水平移動、前肢離地數的垂直移動)、瘤體積(cm3,計算公式:abb/2,a代表腫瘤的長徑,b代表腫瘤的短徑)、估算瘤重(g,瘤重=瘤體積)、生存時間。具體設備與方法參照有關標準[17~19]。1.4擴大組見表1基于實測值的嘴唇r校正①腋溫校正=初次正常組腋溫均數/本次正常組腋溫均數×各樣本實測值;②爪r校正=初次正常組爪r均數/本次正常組爪r均數×各樣本實測值;③尾r校正=初次正常組尾r均數/本次正常組尾r均數×各樣本實測值。1.5體重、濃度及生化指標①痰瘀邪盛=各小鼠瘤重/所有小鼠瘤重均數。>1.5為邪毒甚,>2為邪毒壅盛;<0.75為邪較弱,<0.5為邪弱。②陰虛程度=各小鼠正常或去瘤體重/正常組體重均值。<0.9為陰偏虛,<0.8為陰虛。③氣虛程度=各小鼠水平移動數/正常均數×0.6+各小鼠垂直移動數/正常均數×0.4。>1.5為氣盛,<0.5為氣虛。④陽熱程度=各小鼠校正腋溫/正常組均數×0.3+各小鼠爪校正r/正常組爪r均數×0.5+各小鼠尾校正r/正常組尾r均數×0.2。>1.02為陽偏盛,<0.98陽偏虛,<0.95陽虛。(5)陽氣虛程度=氣虛程度×0.2+陽虛程度×0.8。>1.1為陽氣盛,<0.85為陽氣虛。1.6統計方法2結果2.1小鼠自主活動減少①總體上,荷瘤小鼠腫瘤體積呈持續(xù)增長;去瘤體重呈拋物線狀,中晚期增長平緩(圖1,圖2)。②荷瘤小鼠好奇和自主活動持續(xù)下降,曠場檢測小鼠水平和垂直運動減少(圖3)。③荷瘤小鼠腋溫持續(xù)下降,下降幅度大,嚴重時降幅達9%(圖4)。④荷瘤小鼠爪、尾顏色變淡,反映紅色程度的r值下降。其中爪r的變化顯著,嚴重時降幅達9.2%(圖5)。⑤荷瘤小鼠帶瘤生存時間如圖6,圖中所見,代號為壬、辛、癸等的中藥復方療效較好。2.2不同階段的紅足虱綜合征2.2.1增長迅速者早期偏多腫瘤增長的快慢標志著邪毒的盛衰。荷瘤小鼠腫瘤增長迅速者早期偏多,以后逐漸減少;腫瘤增長緩慢者所占比例逐漸增加,可能與存活時間較長的小鼠腫瘤細胞增生不活躍和體質較好有關(圖7)。2.2.2中期、晚期、期期7d與人類類似,隨著病情的發(fā)展,荷瘤小鼠虛證出現的頻率增加(為簡捷明了,合并陰虛含陰偏虛、陽虛含陽偏虛、陽氣虛含陽氣偏虛);從不同虛證的程度看,氣虛的程度最嚴重,其次是陽氣虛。陽虛恒定,但幅度小,陰虛則不一致,推測與實驗后期所存活動物體質相對較好有關(圖8、9)。研究發(fā)現:①接種后的第7d,證候以邪毒為主,虛證無證可辨接近半數,虛證以單證居多。②接種后的第14d,總體進入中期,邪毒已不是重點,腫瘤體積居中的增加,并保持下去。陰虛和偏陰虛占16%,明顯增加;氣虛比例也顯著上升;陽偏虛、陽虛的比例大幅上升,并均保持下去。對于陽虛如此高發(fā),以往未見報道,可能是小鼠的特點。該階段死亡以陽氣虛為主要原因,因此,扶持陽氣十分必要。此時陰虛多為氣陰兩虛、陰陽兩虛,僅1例為單純陰虛。③第18d,邪毒大多不甚;陽虛比例下降,可能與剩余動物體質較好有關;該階段,單純陰虛出現3例,有所增加。④第21d,該階段小鼠出現大量死亡,集中在陽氣虛、陰陽兩虛。由于陽虛普遍發(fā)生,已無單純的陰虛。⑤第25d,已進入晚期,該階段小鼠出現大量死亡,集中在陽氣虛、陰陽兩虛。⑥第28d,該階段小鼠出現大量死亡,集中在陽氣虛。提示,晚期保護陽氣的重要性。⑦第32d,陽虛減少,而陽氣虛增加,提示氣虛程度的嚴重。2.2.3趨勢和憑證組合與人類類似,隨著病情的發(fā)展,荷瘤小鼠虛證兼證的比例增加。趨勢是無證可辨的數量和比例下降,單證的數量和比例下降;兩證組合變化不大;而3個兼證組合者顯著增加,四證組合從無到有,有增加趨勢(圖10)。2.3般性格狀態(tài)第1次不同組別小鼠的證候改變是不是標準偏差所造成的?同樣標準下,正常小鼠證候表現如何?歷次檢測后辨證結果見表1。從表1可見:①小鼠1號,早期出現2次氣盛/陽偏盛/陽氣盛,中間出現1次氣虛/陽氣虛,以后均正常。小鼠3號,早期出現1次偏陰虛,中間出現1次陽偏虛,其余正常。這2只小鼠可能存在性格波動,或興奮,或壓抑。②小鼠4、8號,前3~4輪一致出現氣盛/陽盛/陽氣盛,以后正常。可能屬于那種早期興奮,以后失去新鮮感者。小鼠5、7、9號,中間出現1~2次氣盛/陽盛/陽氣盛,其余正常。可能屬于那種偶爾興奮一次的。小鼠2、6、10號,中間出現1次氣虛/陽偏虛/陽氣虛,其余正常。這8只小鼠可能存在一定的體質差異,尤其是4、8號小鼠,體質偏熱。③最后兩次檢查各小鼠均在正常范圍,提示隨著飼養(yǎng)延長,小鼠逐漸適應,體質和性格趨同。以上結果與荷瘤小鼠證候持續(xù)發(fā)展形成了鮮明的反差,表明本實驗四診和證候數據是客觀的,是可以真實反映證候及其演變的。2.4痰瘀邪盛證候與預后的關系是否能在荷瘤小鼠出瘤的早期,依據其證候或體質,判斷其預后?我們求出同一日死亡小鼠不同證候的權重平均值,與生存天數比較。其中痰瘀邪盛程度與預后的相關系數為-0.539,P=0.01,具有統計意義,提示荷瘤小鼠早期腫瘤增長迅速者,預后差(圖11)。陰虛程度與預后的相關系數為-0.316,P=0.15,提示早期陰盛(主要由瘤重疊加所致)預后不佳(圖12)。氣虛程度與預后的相關系數為0.275,P=0.21,提示早期氣虛程度嚴重者,預后較差(圖13)。陽虛程度與預后的相關系數為0.236,P=0.29,提示早期陽虛程度嚴重者,預后較差(圖14)。陽氣虛程度與預后的相關系數為0.287,P=0.19,提示早期陽氣虛程度嚴重者,預后較差(圖15)。從以上結果可見:①早期腫瘤增長迅速,體積大,邪毒壅盛者,預后不良。這是決定預后的主要原因。②早期氣盛略優(yōu)于氣虛,陽氣盛略優(yōu)于陽氣虛。此外,我們還觀察到:實驗中,腋溫下降、體重持平和下降是預后差的重要標志。一旦腋溫或體重下降,多瀕臨死亡。與陽氣衰竭、陰虛液脫類似?？傊?痰瘀邪盛證候與預后的關系最為密切,痰瘀邪盛證候越重,其生存期越短。其次與預后有關的證候依照密切程度為陽氣虛、氣虛、陽虛。2.5病料中的制劑的選擇依據荷瘤小鼠虛證復雜和嚴重程度,以及生存天數,總體上癸、己、庚、辛等4張?zhí)幏蒋熜л^好,而丙、丁、戊、壬4張?zhí)幏蒋熜л^差。這些療效較好的處方主要包括清熱解毒、健脾益氣、養(yǎng)陰、行氣破血活血和化痰等治法;藥物涉及半枝蓮、白花蛇舌草、鐵樹葉、石見穿、生山梔,生地黃、山萸肉、炙鱉甲,黨參、黃芪、白術、甘草、淮山藥、紅棗,炒白芍、當歸、三棱、莪術、五靈脂、牡丹皮、雞內金,炒枳實、香附、木香、升麻、柴胡,半夏、陳皮、茯苓、生薏苡等。那么以上療效的取得,單純取決于處方,還是由于分組偏倚,尤其是那些早期邪毒壅盛證候的小鼠分配到那些療效不好的組別中所造成的?我們把療效較差的丙、丁、戊、壬4張?zhí)幏浇M別合并,把療效較好的癸、己、庚、辛等4張?zhí)幏浇M別合并,與模型和正常對照。結果如下。2.5.1組不同偏倚造成療效差異的原因如圖16所示,療效較差的4個組別,早期腫瘤邪毒壅盛,因而其療效差異的主要原因可能是分組偏倚所造成的。鑒于第一次檢查是在用藥后第2天,所以其差異可能還與不同處方療效有一定的聯系。2.5.2氣孔虛早期不同組別的陰虛、氣虛、陽虛、陽氣虛程度類似,以后逐漸有了差別。這種差別可能是腫瘤自然發(fā)生的,也可能受到了藥物影響(圖17~20)。3結論3.1不同日期檢測結果腋溫、爪尾顯微照片雖然采用標準檢測和拍攝,但由于受到設備、環(huán)境等因素的影響,不同日期檢測得到的數據,在所有組別出現了一致的波動,或偏高或偏低。為了前后比較,一律采用初次正常組均數校正。3.2職業(yè)性狀的證候分析①中醫(yī)學通常把腫瘤病機歸結為痰瘀毒。邪毒盛則增長迅速,因此依據腫瘤體積大小,劃分為邪毒壅盛(為所有腫瘤體積均數的2倍)、邪毒甚(1.5倍)、居中,邪較弱(0.75倍)和邪弱(0.5倍),反映邪氣盛衰。②陰虛主要表現為形質減少,例如消瘦、脈細、剝苔等,一旦兼見氣虛、陽虛,熱象往往不顯著。鑒于此,我們把正常或去瘤體重/正常組體重均值,<0.9計為陰偏虛,<0.8計為陰虛。③氣虛的重要標志是乏力,突出表現為運動減少。小鼠曠場移動是很好的檢測方法。在曠場中,小鼠表現為水平移動,以及直立兩種主要運動方式。相比之下,水平移動區(qū)域廣,差別大。因此我們取各小鼠水平移動格數/正常移動均數×0.6+各小鼠抬頭起立數/正常均數×0.4,與正常組均數相比,>1.5計為氣盛,<0.5計為氣虛。④陽熱盛衰的重要標志包括體溫和體表顏色,陽熱盛往往表現為體表溫度高、面紅目赤。從小鼠爪、尾標準攝像中,可以提取反映紅色程度的r值,r值愈高表示爪愈紅。鑒于小鼠腋溫波動較大,以及爪反映紅色的程度和靈敏度優(yōu)于尾,我們采用各樣本校正腋溫/正常均數×0.3+各樣本爪校正r/正常爪r均數×0.5+各樣本尾校正r/正常尾r均數×0.2的運算公式,求出各小鼠的陽熱指數,并依據數據分布,初步設定為>1.02為陽偏盛,<0.98陽偏虛,<0.95陽虛。⑤陽氣集中代表了氣和陽的綜合特征。鑒于小鼠曠場移動頻率波動較大,我們采用氣虛程度×0.2+陽虛程度×0.8來綜合反映陽氣盛衰程度,與正常組均數相比,>1.1為陽氣盛,<0.85為陽氣虛。以上證候閾值的確定,是參照臨床特點和實測數據分析后作出的。至于如何驗證和獲得最佳閾值,需要大量的實驗驗證。但是,作為統一的標準,這樣的閾值對所有小鼠是一致的,因而是可以比較的。3.3不同節(jié)點的治療①荷瘤小鼠氣虛的程度最嚴重。②荷瘤小鼠腋溫逐漸下降,類似的爪、尾紅色程度一致下降,表明荷瘤小鼠具有典型的陽虛證候,并成為該病的主要證候之一。③腫瘤邪毒證候貫穿始終。其程度早期差異大,腫瘤增長或快或慢,以后逐漸趨同,增長緩慢的個體比例逐漸增加,這可能與存活時間長的小鼠腫瘤細胞的不活躍和體質較好有關。因此,早、中、晚不同節(jié)點的治法應有所區(qū)別。④荷瘤小鼠的兼證和證候演變與人類類似,隨著病情的發(fā)展,兼證的比例增加;趨勢是無證可辨、單證數量和比例下降,復合證顯著增加。⑤通過對正常小鼠證候觀察,表明正常小鼠存在一定的體質差異,而歷次檢測,所獲得數據基本是穩(wěn)定的,集中在正常范圍之內,提示我們所建立的工作站和方法、標準是可行的,也是可以真實反映證候及其演變的。3.4荷蘭瘤鼠的預后3.5診檢測指標的發(fā)展是前提①在小鼠證候采集中,首次采用了標準化的四診檢測技術,所有指標實現了計量化、標準化、客觀化;小鼠證候的嚴重程度實現了量化描述;該方法的建立有助于療效評價。②所有小鼠的辨證采用了統一的標準,計算機計量辨證,避免了人工辨證帶來的誤差。③客觀揭示了荷瘤小鼠與人類類似,證候及其兼證會逐漸增加,日漸嚴重,因此可以很好地模擬臨床腫瘤證候的演變,用于病證結合研究。④采用疾病模型,通過非創(chuàng)傷性的四診手段,觀察疾病狀態(tài)下證候的自然發(fā)生及其演變,從而可以避免以方測證、微觀辨證、病證疊加造模等方法的局限,為中醫(yī)藥病證結合和辨證論治的基礎研究提供了方法學,具有重要的學術意義和應用價值。本研究存在的問題在于所選擇的四診檢測指標還很有限。鑒于中醫(yī)臨證的特點是通過望聞問切采集四診指標,方便、實用、經濟、有效,鑒于此,我們依據文獻和我們的經驗,業(yè)已建立了系列標準[17~19],但付諸大樣本的檢測,工作量大,檢測質量難以控制。因此,如何進一步探索和發(fā)展小鼠四診檢測指標,重在實用和有效,是我們今后努力的方向。采用SPSS11.5統計軟件進行相關分析。(1)總體上,荷瘤小鼠預后與早期腫瘤增長速率(邪毒盛衰)密切相關,早、中期腫瘤增長迅速者,生存期往往較短。由此得到的啟迪是:①不同治法的療效比較與評價,要求荷瘤小鼠接種出瘤后,依據腫瘤出瘤先后、大小分層隨機分組,避免分組偏倚,影響療效判斷;②早期控制腫瘤的迅速增長十分必要。(2)總體看,荷瘤預后與氣和