酵母蔗糖酶米氏常數(shù)的測定

酵母蔗糖酶米氏常數(shù)的測定[原理]當環(huán)境的溫度、pH和酶濃度等條件恒定時，酶促反應的初速度V隨底物的濃度[S]增高而加快，直至達到一極限，即最大反應速度Vmax。根據(jù)底物濃度和反應速度的這種關(guān)系，Michaelis-Menten推導得出如下公式：V=V=Vmax[S]Km+[S]式中Km為米氏常數(shù)。它是酶的特征性常數(shù)。測定Km是研究酶的一項重要工作。大多數(shù)酶Km在10-3～10-5mol/L左右。但是Michaelis-Menten方程中反應速度V與底物濃度[S]之間為雙曲線關(guān)系，通過作圖求Km值極不方便。Lineweaver-Burk根據(jù)米氏方程又推導出如下直線方程：11V=·1Vmax1[S]+KmVmax以1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標，將各點連成一直線，此線向左延長與橫軸相交處即為米氏常數(shù)（Km）的負值。本實驗是用比色法測定一定時間內(nèi)、一定量的蔗糖酶作用于不同濃度的底物（蔗糖）生成產(chǎn)物的量，即葡萄糖的量。此產(chǎn)物的生成量為反應速度，然后按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖（圖14），就可以求出Km值。11[S]1v1Vmax1Km圖14Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[試劑]1．0.03mol/L蔗糖溶液。2．0.2mol/LpH5.0醋酸緩沖液：取0.2mol/L醋酸鈉溶液70ml與0.2mol/L乙酸溶液30ml相混合。3．蔗糖酶溶液：干酵母2.5g置研缽中，加蒸餾水4ml，用力研磨10分鐘，轉(zhuǎn)移到離心管中，用25ml蒸餾水洗研缽，并將洗滌液一起轉(zhuǎn)移到離心管中，搖勻，靜置50分鐘，離心（2000r/min5min），小心取出上清夜備用。置冰箱保存。實驗時根據(jù)需要用蒸餾水適當稀釋。（約25倍稀釋）4．堿性硫酸銅溶液：取無水Na2CO340g溶于400ml蒸餾水中；酒石酸7.5g溶于350ml蒸餾水中；結(jié)晶硫酸銅（CuSO4·5H2O）4.5g溶于200ml蒸餾水中，以上分別加熱促溶。冷卻后將酒石酸溶液傾入Na2CO3溶液中，混勻。再將硫酸銅溶液傾入，并加蒸餾水至總量為1000ml。此試劑可在室溫中長期保存。如放置數(shù)周后生成沉淀，可用優(yōu)質(zhì)濾紙過濾后使用。5．磷鉬酸試劑：燒杯內(nèi)加入鉬酸70g，鎢酸鈉10g，10%NaOH溶液400ml及蒸餾水400ml。煮沸20～40分鐘以除去鉬酸內(nèi)可能存在的氨。冷卻移入1000ml容量瓶內(nèi)，加濃磷酸（85%）250ml，混勻。最后以蒸餾水稀釋至1000ml。6．葡萄糖標準溶液（0.05mg/ml）：（1）葡萄糖標準貯存溶液：（10mg/ml）：以分析天平稱取1.000g純葡萄糖，置于小燒杯中加0.25%苯甲酸溶液使溶解，傾入100ml容量瓶中以0.25%苯甲酸溶液稀釋至刻度。（2）葡萄糖標準應用液（0.05mg/ml）：用吸管吸取上述葡萄糖標準貯存液5.0ml放入1000ml容量瓶內(nèi)，用0.25%苯甲酸溶液稀釋致刻度。[主要器材]恒溫水浴及沸水浴721分光光度計[主要操作步驟]將蔗糖酶溶液置30℃水浴預溫5分鐘。取試管5支，編號，按表14操作。表14管號12345試劑（ml）管號12345試劑（ml）0.03mol/L蔗糖溶液5.02.51.51.00蒸餾水02.53.54.05.0pH5.0醋酸緩沖液0.50.50.50.50.5充分混勻，30℃水浴預溫5分鐘蔗糖酶溶液0.50.50.50.50.5立即混勻，30℃水浴準確保溫10分鐘堿性硫酸銅溶液1.01.01.01.01.0混勻，中止酶反應。另取試管6支，編號。向1～5管加入上面相對應的5管反應液各0.5ml，再各加蒸餾水1.5ml；第6管加入葡萄糖標準液2ml。然后按表15操作：表15試劑（ml）管號123456試劑（ml）管號123456堿性硫酸銅溶液2.02.02.02.02.02.0混勻，置沸水浴8分鐘，取出冷卻磷鉬酸試劑2.02.02.02.02.02.0混勻，靜置3分鐘蒸餾水2.02.02.02.02.02.0將各管混勻，選用420nm波長比色，以第5管作為空白管調(diào)零，第6管作為標準管，記錄各管光密度。[結(jié)果與計算]1～4號管酶促反應所產(chǎn)生的還原糖的mol數(shù)按下式計算：測定管光密度測定管光密度標準管光密度還原糖(mol)=1000180×0.1××7.00.5按