藤茶中二氫楊梅素的提取工藝研究

藤茶中二氫楊梅素的提取工藝研究

藤茶屬于青桃科，蛇葡萄科的學(xué)名是顯齒蛇葡萄。它甜、輕、新鮮。具有清熱解毒、風(fēng)濕、肌肉骨骼僵硬、消炎、鎮(zhèn)痛等功效。民間將其幼嫩莖葉制成保健茶，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、皰癤等癥已有數(shù)百年的歷史，是一種典型的藥食兩用植物。藤茶主要有效成分為黃酮類化合物，并以二氫楊梅素(Dihydromyricetin，簡稱DMY)含量最高。研究表明，藤茶中總黃酮含量為43.4%～44.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，二氫楊梅素含量高達(dá)37.4%～40%，但與地理、氣候環(huán)境等因素有關(guān)。近年來，國內(nèi)外已有部分學(xué)者開展了從植物中提取二氫楊梅素的研究，通常是以有機(jī)溶劑為提取劑，如醋酸乙酯、正丁醇、乙醇等。這種方法提取成本高，回收溶劑的能耗高，還存在費(fèi)時(shí)、提取率低、重現(xiàn)性差等不足之處。而且所用溶劑通常有毒，不安全，易對(duì)環(huán)境和操作人員造成危害。超臨界萃取二氫楊梅素雖具有節(jié)省試劑，無污染等優(yōu)點(diǎn),但回收率較差，為了獲得超臨界條件，設(shè)備一次性投資較大，運(yùn)行成本高。此外，還有大孔樹脂吸附法、微波萃取法、逆流法、乙醇輔助法及超聲波輔助溶劑提取法。本課題組通過對(duì)二氫楊梅素理化性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素是極性化合物，在熱水和冷水中的溶解度差別很大，因此可用熱水作為提取劑。本研究以藤茶為原料，熱水為提取劑，采用適量熱水梯度提取，節(jié)約了用水量和能源，探索出一條適宜于中小型企業(yè)生產(chǎn)二氫楊梅素的工藝，為今后開發(fā)利用二氫楊梅素類新產(chǎn)品提供理論參考。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1高效液相色譜儀JFSD-70型實(shí)驗(yàn)室粉碎磨(上海嘉定糧油檢測儀器廠)；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；2010HAT高效液相色譜儀(日本島津)；檢測器：紫外；色譜柱：Hypersil300AC18柱；20目篩；真空泵；索氏提取器。1.1.2二氫蝦素對(duì)照品藤茶干燥莖葉：經(jīng)索氏提取法提取測定二氫楊梅素含量為33.18%，二氫楊梅素對(duì)照品(純度≥98%)(以上原料由湖南保靖縣秦簡茶科技有限公司提供)；95%食用酒精(湖南酒鬼酒股份有限公司提供)；石油醚、無水乙醇、無水甲醇(分析純)；水為蒸餾水。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1乙醇法提取精確稱取粉碎后并過20目篩的干燥藤茶粉末5g，置索氏提取器中，用石油醚適量加熱回流2h，脫脂后的樣品，用無水乙醇于80℃加熱回流，提取6h，得醇提取液，趁熱過濾，濾液水浴蒸除部分乙醇，濃縮液移至干燥皿，干燥至恒重，得提取物。平行做5次，取平均值。測定原料中二氫楊梅素含量為33.18%。1.2.2粗提取物的制備稱取一定量粉碎后并過20目篩的藤茶粉末于錐形瓶中，加入一定量的熱水溶解，置于恒溫水浴鍋中浸提，一段時(shí)間后，趁熱抽濾，待冷卻至室溫置于冰箱中靜置，析出白色晶體，過濾，得到濾渣（二氫楊梅素在高溫時(shí)溶解度很大，低溫時(shí)溶解度很低，結(jié)晶析出），干燥至恒重，得粗提取物。1.2.3次提取法稱取一定量粉碎后并過20目篩的藤茶粉末于錐形瓶中，加入一定量的熱水溶解，在恒溫水浴鍋中浸提后，趁熱抽濾；濾渣加等量的熱水，在相同條件下浸提一段時(shí)間，趁熱抽濾；濾渣加少量熱水清洗后再過濾，合并濾液，可得到浸提液。冷卻靜置后，過濾，得到濾渣，干燥至恒重，得粗提取物。其中，總用水量和提取時(shí)間與一次提取法相同。取由以上方法制備的二氫楊梅素干燥粗提取物按1:20的比例添加蒸餾水，加熱使粗提取物充分溶解，趁熱抽濾，濾液置于4℃冰箱中靜置24h，有大量白色晶體析出，過濾，干燥濾渣，濾渣即為本試驗(yàn)中所用的初步純化的二氫楊梅素。用HPLC法測定其中二氫楊梅素含量。1.3測量1.3.1提取率計(jì)算方法二氫楊梅素的純度采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行測定。1.3.2高效液相層析成像測定二羥楊梅的含量1.3.2.檢測波長及進(jìn)樣量色譜柱：Hypersil300AC18柱；檢測波長：UV-294nm；流動(dòng)相：甲醇-水（體積比24:76）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：25℃。1.3.2.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測定精密稱取已知含量的二氫楊梅素對(duì)照品10mg(準(zhǔn)確至0.01mg)于50mL燒杯中，攪拌溶解，用無水甲醇定容至100mL容量瓶中，充分搖勻，用0.45μm濾膜過濾備用。按1.3.2.1的色譜條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測定。二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜見圖1，該條件下，二氫楊梅素的保留時(shí)間為5.180minㄢ1.3.2.濾膜的制備精密稱取初步純化得到的樣品10mg，用無水甲醇在50mL燒杯中攪拌溶解，定容至100mL容量瓶中，充分搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾備用。按1.3.2.1中的色譜條件，采用外標(biāo)一點(diǎn)法對(duì)樣品溶液進(jìn)行測定。2結(jié)果與討論2.1單因素試驗(yàn)影響二羥楊梅提取率2.1.1不同提取溫度對(duì)提取率的影響稱取10份50g粉碎并過20目篩的藤茶粉末于10個(gè)相同錐形瓶中，在料液比為1:20，提取時(shí)間為60min,pH為7的條件下，提取溫度分別為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，對(duì)一次提取法和二級(jí)提取法作比較，試驗(yàn)結(jié)果見表1ㄢ由表1可知，二氫楊梅素的提取率隨著溫度的提高而增大。當(dāng)溫度低于70℃時(shí)，提取率非常低。分兩級(jí)提取的提取率明顯高于一次提取的提取率，這表明多次提取的效果較好，而且在提取溫度為90℃以上時(shí)，二級(jí)法提取率比一次提取法約高10%。二氫楊梅素在熱水中的溶解度較高，但提取溫度不能超過100℃，一方面受實(shí)驗(yàn)條件限制，另一方面在100℃以上提取時(shí)，其他黃酮類會(huì)被提取出來，影響測定結(jié)果?？紤]到工廠生產(chǎn)成本，選取80～100℃之間為正交試驗(yàn)的水平范圍。2.1.2不同提取時(shí)間對(duì)二氫楊樹葉片中二氫蝦素提取率的影響稱取10份50g粉碎并過20目篩的藤茶粉末于10個(gè)相同錐形瓶中，在提取溫度為90℃，料水比為1:20,pH為7的條件下，提取時(shí)間分別為30min、45min、60min、75min、90min，對(duì)一次提取法和二級(jí)提取法作比較，試驗(yàn)結(jié)果見表2ㄢ由表2知，提取時(shí)間少于60min時(shí)隨著提取時(shí)間的延長，原料中二氫楊梅素的提取率會(huì)增大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到60min以后，提取率增加不明顯?？梢酝茢?，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60min時(shí)，溶液體系中原料細(xì)胞內(nèi)外二氫楊梅素的濃度將達(dá)到平衡。此時(shí)再延長提取時(shí)間，只會(huì)有助于其它雜質(zhì)的溶出。在提取溫度、料液比以及pH值相同條件下，二級(jí)法的提取效果明顯比一次提取法好，提取時(shí)間為60min時(shí)，提取率約高10%。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，二級(jí)提取法提取時(shí)，提取時(shí)間若過長，提取液的黏度會(huì)變大，形成一種膠體狀溶液，難以過濾，所得沉淀物細(xì)小，難以自然沉降和分離，操作過程中損失嚴(yán)重，從而導(dǎo)致實(shí)際收率下降。因此，不必?zé)o限制地延長提取時(shí)間；從節(jié)能角度考慮提取時(shí)間為60min較好。故選取30～90min為正交試驗(yàn)水平范圍。2.1.3料液比對(duì)二氫楊樹葉片提取率的影響稱取10份50g粉碎并過20目篩的藤茶粉末于10個(gè)相同錐形瓶中，在提取溫度為90℃,提取時(shí)間為60min,pH7的條件下，料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，對(duì)一次提取法和二級(jí)提取法作比較，試驗(yàn)結(jié)果見表3ㄢ由表3可知，隨著料液比的提高，原料中二氫楊梅素的提取率不斷增加，當(dāng)料液比達(dá)到1:25時(shí)，提取率增加不明顯?？梢?，在此條件下，原料中的二氫楊梅素溶出比較完全，沒有必要繼續(xù)增大料液比。二級(jí)法提取比一次提取的提取率要高，料液比為1:25時(shí)，約高10%。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比太低，如1:10時(shí)，由于溶液黏度太高而不利于二級(jí)提取。二氫楊梅素在原料中的含量隨原料來源、品質(zhì)和儲(chǔ)存時(shí)間的不同而有很大差異，故在實(shí)際生產(chǎn)中，要根據(jù)實(shí)際，先做小試以找到最佳的料液比。所以，選取1:15～1:30為正交試驗(yàn)的水平范圍。2.1.4兩種提取方法的比較稱取10份50g粉碎并過20目篩的藤茶粉末于10個(gè)相同錐形瓶中，在提取溫度90℃,提取時(shí)間為60min，料液比為1:25,pH值分別為5、6、7、8、9的條件下，對(duì)一次提取法和二級(jí)提取法作比較，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，在pH值為5～9的范圍內(nèi)，pH值的變化對(duì)二氫楊梅素的提取率影響并不顯著。在弱酸性和弱堿性條件下，二氫楊梅素的提取率略高于中性條件，而弱堿性條件下的提取率比弱酸性條件下的提取率高1%左右。二氫楊梅素的等電點(diǎn)在5.0左右，所以在弱堿性條件下更有利于二氫楊梅素的提取。但堿性不可太強(qiáng)，因?yàn)槎錀蠲匪卦趶?qiáng)堿性條件下會(huì)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。在酸性條件下，原料的細(xì)胞壁更容易軟化，也有利于二氫楊梅素的溶出。綜合考慮本次實(shí)驗(yàn)，調(diào)節(jié)pH值為8左右比較好，二級(jí)提取效果更好。2.2級(jí)數(shù)對(duì)二氫楊樹葉片提取率的影響在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度為90℃，料液比為1:25,pH值為8的條件下提取60min，考察提取級(jí)數(shù)對(duì)原料中二氫楊梅素提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：從圖2中可以看出，二級(jí)提取法的提取率顯著高于一次提取的提取率，在二級(jí)提取以后，再增加提取級(jí)數(shù)，提取率趨于平穩(wěn)狀態(tài)。原因可能是二氫楊梅素的提取已達(dá)到飽和，而增加提取級(jí)數(shù)，提取效果變化很小，無實(shí)際意義，而且還加大了工藝的工作量。因此，本試驗(yàn)采用的二級(jí)提取法比較得當(dāng)。2.3氫楊樹葉片中二氫蝦素最佳提取條件的確定根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、提取時(shí)間、料液比作為試驗(yàn)因素進(jìn)行考察，各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表及試驗(yàn)結(jié)果分別見表5、表6ㄢ正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)原料中二氫楊梅素提取效果的影響大小順序?yàn)椋篈>B>C，即提取溫度對(duì)二氫楊梅素的提取率影響最大，提取時(shí)間影響次之，料液比影響較小。綜合試驗(yàn)結(jié)果得出二氫楊梅素的最佳提取條件為：A3B2C3，即提取溫度為95℃，提取時(shí)間為60min，料液比為1:25。在此最佳參數(shù)組合條件下，二氫楊梅素提取率最高。重做試驗(yàn)8和正交最佳提取條件試驗(yàn)，其結(jié)果如表7所示。從表7可知，在最佳提取條件下的提取率為30.81