轉(zhuǎn)座子的功能與應用

轉(zhuǎn)座子的功能與應用

又名跳軸，也被稱為跳躍因子，它的實質(zhì)是一個沒有必要通過同源序列移動的dna段，并且可以直接從組合的某個點移動到另一個點。自1951年美國McClintock在玉米中首先發(fā)現(xiàn)了DNA轉(zhuǎn)座子以來,轉(zhuǎn)座子已成為各種生物基因分析的有效工具之一。不僅可利用轉(zhuǎn)座子誘變找到原核生物的單性生殖基因,而且在真核生物中,轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)和運用極大地促進了果蠅遺傳學的發(fā)展。人們已經(jīng)應用各種方法,在生物界各個領域證實了轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的廣泛存在。利用轉(zhuǎn)座子特有的轉(zhuǎn)座功能,將帶有標記的轉(zhuǎn)座子插入目的基因或基因組,產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)、轉(zhuǎn)座子定點雜交技術(shù)、轉(zhuǎn)座子基因打靶技術(shù)和非病毒載體基因增補技術(shù)。人們利用這些技術(shù),可以確定基因組的功能、基因組間的功能差異;可以改變目的基因的活性,獲得轉(zhuǎn)基因生物;可以阻斷毒力基因,獲得基因疫苗;可以促進基因整合,進行基因治療等。轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)改變了人們對基因組序列穩(wěn)定性的認識,打破了遺傳物質(zhì)在染色體上呈線性固定排列的傳統(tǒng)理論。轉(zhuǎn)座子插入新的位點后,該位點附近的基因即受到抑制而呈現(xiàn)隱性的“睡美人”表型。一旦轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下從這一位點上轉(zhuǎn)走,該位點的基因隱性表型又恢復為顯性表型,即“睡美人蘇醒”。調(diào)控轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子活性的系統(tǒng)稱為“青蛙王子(FrogPrince)”。目前,認為多數(shù)生物體有自發(fā)突變且有重要表型效應出現(xiàn)都源于轉(zhuǎn)座子的可動性,并且可以導致宿主基因組發(fā)生從點突變到染色體重排的一系列變化。轉(zhuǎn)座子在進化上為建立宿主基因特性起著重要作用。用特異的開放閱讀框捕獲技術(shù),可以使自然散在的轉(zhuǎn)座酶編碼基因高度表達,人為催化激活轉(zhuǎn)座子使其“蘇醒”,執(zhí)行插入、黏貼、切除等任務。目前已經(jīng)應用于微生物、昆蟲、植物、動物及人類基因組功能的研究,例如蛙類基因組含有“水手”轉(zhuǎn)座子超家族,呈自然失活狀態(tài),轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座增強子序列末端結(jié)合,在蛋白協(xié)助下,激活轉(zhuǎn)座子,使睡美人轉(zhuǎn)座子蘇醒。1轉(zhuǎn)向座子類型1.1不同的基因組dna轉(zhuǎn)座子DNA轉(zhuǎn)座子是以DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子,可通過DNA復制或直接切出2種方式獲得可移動片段,重新插入基因組DNA中,導致基因的突變或重排,但一般不改變基因組的大小。根據(jù)轉(zhuǎn)座的自主性,DNA轉(zhuǎn)座子又分為自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子,前者本身能夠編碼轉(zhuǎn)座酶而進行轉(zhuǎn)座,后者則要在自主轉(zhuǎn)座子存在時才能實現(xiàn)轉(zhuǎn)座。玉米的Ac/Ds體系就是典型轉(zhuǎn)座因子,活化子Ac屬于自主轉(zhuǎn)座子,解離子Ds屬于非自主轉(zhuǎn)座子,只有在Ac存在時,Ds才能轉(zhuǎn)座。1.2反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以DNA-RNA-DNA的途徑來實現(xiàn)轉(zhuǎn)座,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中的拷貝數(shù)得到不斷積累,從而使基因組增大。由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子帶有增強子、啟動子等調(diào)控元件,所以會影響宿主基因的表達。在生物進化過程中,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子起著不可忽視的作用。這類轉(zhuǎn)座子是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于高等植物中可活動的遺傳成分。根據(jù)是否具有編碼反轉(zhuǎn)錄酶的能力,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可分為2個家族:自主性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非自主性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子;按照序列結(jié)構(gòu)中有無長末端重復序列(LTR)又可分為有LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和無LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。自主性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)、LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及長散在元件(LINEs);非自主性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括短散在元件(SINEs)及修飾性反轉(zhuǎn)錄假基因。2董事會的特征和董事會機制2.1反向重復序列的檢測無論是在原核生物還是在真核生物體中,轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)上都有2個特點:轉(zhuǎn)座子的兩端分別有一個DNA倒置重復序列,稱為末端反向重復序列,不同轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)該序列長度不同;在轉(zhuǎn)座子重新整合的位點,轉(zhuǎn)座子一側(cè)有一個正向DNA重復序列,這些重復序列的長度也因不同的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)而存在差異。2.2轉(zhuǎn)座酶基因分子轉(zhuǎn)座的機制實質(zhì)就是DNA的擴增和重組。轉(zhuǎn)座是生物進化的重要手段,對于轉(zhuǎn)座的機制,長期以來形成了一種固定模式,即轉(zhuǎn)座是通過反向轉(zhuǎn)錄酶的中介作用,以DNA為實體插入轉(zhuǎn)座子的模式,其模式有2種:RNA→DNA→插入點;DNA→RNA→DNA→插入點。這種理論解釋了長序列基因的轉(zhuǎn)座,而對于大量的短片段的、亞基因的轉(zhuǎn)座卻是以RNA為中介的調(diào)控反應結(jié)果,又稱為調(diào)控轉(zhuǎn)座,即先有調(diào)控后有轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座是調(diào)控反應的結(jié)果。所以有學者認為,轉(zhuǎn)座的實體應當是RNA,而不是DNA,并且不一定要通過反向轉(zhuǎn)錄酶為中介,轉(zhuǎn)座子都具有編碼與轉(zhuǎn)座作用有關的酶-轉(zhuǎn)座酶的基因,而末端大多數(shù)都是反向重復序列。轉(zhuǎn)座酶既識別轉(zhuǎn)座子的兩個末端,也能與靶位點序列結(jié)合。轉(zhuǎn)座作用的機制是轉(zhuǎn)座子插到新的位點上產(chǎn)生交錯切口,所形成的突出單鏈末端與轉(zhuǎn)座子兩端的反向重復序列相連,然后由DNA聚合酶填補缺口,DNA連接酶封閉切口,交錯末端的產(chǎn)生與填補說明了靶DNA在插入位點存在正向重復,兩條鏈上切口之間的交錯取決于正向重復的長度。因此,每個轉(zhuǎn)座子所特有的靶重復序列反映了切割靶DNA的酶的幾何形狀。3使用轉(zhuǎn)向?qū)ο?.1尋找新基因，確定生物聚集功能3.1.1轉(zhuǎn)座子突變體的確定和應用轉(zhuǎn)座子具有可選擇的抗性標記而容易在體內(nèi)鑒定突變,經(jīng)轉(zhuǎn)座子誘變的突變子含有已知的DNA片段,可以通過轉(zhuǎn)座子序列的雜交來鑒定突變基因的位置,經(jīng)轉(zhuǎn)座子誘變的突變體具有高度的極性,使得被誘變的基因以及同一操縱子內(nèi)的下游基因完全喪失功能。正因為以上轉(zhuǎn)座子的特征,轉(zhuǎn)座子才被廣泛應用于構(gòu)建插入突變體庫,現(xiàn)已成為研究基因功能的重要手段之一。目前研究和應用得較多的有Tn10、Tn5、Tn3和Mu噬菌體,其機制是所有轉(zhuǎn)座子都攜帶其轉(zhuǎn)座所必需的基因,因而轉(zhuǎn)座作用不依賴于轉(zhuǎn)座子和靶點之間以及供點和靶點之間任何的序列同源性。轉(zhuǎn)座子插入后,插入或是妨礙了轉(zhuǎn)錄,或是妨礙了翻譯,從而使靶點處的基因失活。而且插入往往表現(xiàn)出極性效應,即轉(zhuǎn)座子在操縱子上游基因的插入影響到下游基因的表達,原因是轉(zhuǎn)座子序列中含有終止子或終止密碼子,造成轉(zhuǎn)錄或翻譯終止,由此影響到后續(xù)基因的表達,進而依靠表型鑒定出突變體。目前轉(zhuǎn)座子突變體已應用于生物體基因的鑒定,HudsonP等利用Tn4001mod轉(zhuǎn)座子構(gòu)建突變株,鑒定雞敗血支原體的毒力相關因子。TaeokBae等運用轉(zhuǎn)座技術(shù)尋找葡萄球菌的毒力基因。構(gòu)建突變體庫的關鍵技術(shù)是轉(zhuǎn)座子的選擇。需要選擇轉(zhuǎn)座隨機性好的轉(zhuǎn)座子,例如之前大量研究證明Tn5轉(zhuǎn)座子具有很好的轉(zhuǎn)座隨機性,但Jacobs等的研究結(jié)果仍然發(fā)現(xiàn),該系列轉(zhuǎn)座子在銅綠假單胞菌PAO1基因組中的轉(zhuǎn)座插入采樣數(shù)不符合泊松分布,但最終還是獲得了一個近飽和的突變株庫。而Garsin等在構(gòu)建糞腸球菌的Tn917轉(zhuǎn)座插入突變株庫時發(fā)現(xiàn),測序的8865個Tn917轉(zhuǎn)座突變株突變基因只對應了610個不同的開放閱讀框,遠遠低于預期的2400個。這些結(jié)果說明,使用隨機性差的轉(zhuǎn)座子會大大增加建庫的成本。對突變基因測定方法采用隨機引物PCR的方式,以達到自動化的目的。隨機引物PCR采用機器自動化進行,使測序工作完全不需要人工的參與,達到省時省力的目的,從而使建庫所耗時間和精力大大降低,這樣可以由一個研究組完成而不需要大規(guī)模的協(xié)作。3.1.2ac/ds轉(zhuǎn)座子生物學特點利用轉(zhuǎn)座子標簽法分離基因的優(yōu)點:①轉(zhuǎn)座子插入引起的突變會由于轉(zhuǎn)座子的切離而回復。由于轉(zhuǎn)座子的不斷跳躍,一旦把轉(zhuǎn)座子導入目標植物,如通過自交、雜交等手段,轉(zhuǎn)座子Ac/Ds的番茄轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)雙價基因?qū)μ岣叻亚嗫莶】剐缘难芯勘憧傻玫揭粋€較大的含不同插入位點的轉(zhuǎn)座子群體。②把轉(zhuǎn)座子導入異源植物不受轉(zhuǎn)化條件的限制。與T-DNA相比,Ac/Ds轉(zhuǎn)座子不但對基因組小的植物是行之有效的,如擬南芥等,而且對水稻、小麥等基因組很大的植物也可以獲得足夠的插入突變體。③轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的突變可以與表型共分離,可以產(chǎn)生恢復突變以檢測突變是否插入。因此,在克隆、分離基因方面,轉(zhuǎn)座子比T-DNA標簽具有更大的潛力。3.2用座位法培育旋轉(zhuǎn)動物3.2.1piagybac轉(zhuǎn)座子研究親緣關系較遠的昆蟲的轉(zhuǎn)座子能夠切出并發(fā)生轉(zhuǎn)座,這為獲得轉(zhuǎn)基因動物提供了條件。目前,已成功獲得的有轉(zhuǎn)基因地中海果蠅、轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅、轉(zhuǎn)基因家蠶。piggyBac轉(zhuǎn)座子的準確切出總是伴隨著轉(zhuǎn)座,在轉(zhuǎn)座時能夠攜帶外源基因進入受體基因中,并且允許在新的基因組中表達。攜帶的基因沒有大小限制,在地中海果蠅、黑腹果蠅、家蠶等3個親緣關系較遠的昆蟲中,能作為一個高效、穩(wěn)健的載體對基因轉(zhuǎn)移,并促進生殖種系轉(zhuǎn)化。3.2.2病毒載體轉(zhuǎn)化斑馬魚轉(zhuǎn)座子導入魚類的研究主要集中在斑馬魚的研究。多年前,已利用顯微注射技術(shù)成功制備出轉(zhuǎn)基因斑馬魚,而且轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)了種系傳遞,但種系傳遞的效率只有0~20%,轉(zhuǎn)基因的表達也不穩(wěn)定。后來,利用假型反轉(zhuǎn)錄病毒作載體,可提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率和種系的傳遞效率,且已用于斑馬魚胚胎發(fā)生的相關基因的克隆和突變。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),mariner/Tc1家族的轉(zhuǎn)座元件也可轉(zhuǎn)化脊椎動物,如在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的Tc3轉(zhuǎn)座元件已成功轉(zhuǎn)化斑馬魚。斑馬魚基因組插入轉(zhuǎn)座子可迅速確定其必需基因.3.2.3缺乏有效的非病毒抑制劑系統(tǒng)近年來,禽蛋生物反應器以其自身的優(yōu)勢而逐漸成為新的研究熱點,但制備轉(zhuǎn)基因禽類尚缺少一種有效的、非病毒介導的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),這使得該系統(tǒng)發(fā)展緩慢。據(jù)Roslin研究所的研發(fā)人員報道,一種利用mariner轉(zhuǎn)座元件將外源基因高效導入雞基因組的方法,提高了外源基因在雞基因組的整合效率,展示了制備轉(zhuǎn)基因禽類的發(fā)展前景。3.2.4小鼠和其他臟器中轉(zhuǎn)座子的應用過去,轉(zhuǎn)座子元件只是在低等生物中進行轉(zhuǎn)基因和插入突變研究,相反,由于缺乏一個有效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),轉(zhuǎn)座子在小鼠和其他脊椎動物中的應用受到限制。上海復旦大學發(fā)育生物學研究所的科研人員將一種源于飛蛾的PB轉(zhuǎn)座子,用于小鼠和人類細胞的基因功能研究,他們發(fā)現(xiàn)PB轉(zhuǎn)座因子可在人等哺乳動物的細胞株中高效導入基因并穩(wěn)定表達,為體細胞遺傳學的研究和基因表達提供了一個高效、便捷的新系統(tǒng)。3.3生長分析診斷工具轉(zhuǎn)座子通常限制性地分布于特定的真菌菌株或群體中,可以作為特定菌株的診斷工具,已用于絲狀真菌群體多樣性分析。在醫(yī)藥工業(yè)方面已用于有益菌株的鑒別,在植物病理學方面已用于鑒別特定的病原。3.4促進微生物分解代謝由于基因的可變性及轉(zhuǎn)座子的遺傳調(diào)控,許多微生物能夠利用人工合成的化學物質(zhì),與微生物分解代謝相關的基因往往與插入元件相連。當環(huán)境污染時,轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移頻率提高,增加了微生物種群的生物降解潛力。3.5第二,基于雙鏈tn5轉(zhuǎn)座子檢測細胞不良反應胚胎干細胞同源重組、基因突變定位已發(fā)展成為研究人類疾病動物模型的有效研究工具。干細胞的多向分化性結(jié)合“睡美人”轉(zhuǎn)座子的定向點特異性修復能力,使基因修復且無需進行體外細胞培養(yǎng)治療多種疾病稱為可能?；陔p鏈Tn5轉(zhuǎn)座子插入的染色體缺失系統(tǒng)可用于少量基因組制備和必需基因的分析。Dupuy等用鼠胚