不同方法檢測因素檢測的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)比較

不同方法檢測因素檢測的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)比較

氨基金屬酶-pmp-2和pmp-9是主要的硝基金屬酶菌株，與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)化之間有著密切的關(guān)系。近年來,對MMP-2、MMP-9的研究較為深入和廣泛,研究方法也分門別類。就蛋白水平而言,主要實驗手段有免疫組織化學(xué)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸收檢測、膠原底物降解檢測、Westernblot印跡、Southwestern印跡、明膠酶譜法等等。各種方法側(cè)重點不盡相同,其中免疫組織化學(xué)和免疫熒光重點在蛋白的組織定位和半定量,酶聯(lián)免疫吸收檢測、膠原底物降解檢測、Westernblot印跡、Southwestern印跡幾種方法在嚴(yán)格控制實驗條件的前提下可以做到蛋白定量檢測,而明膠酶譜則能夠區(qū)分酶原和活化酶。若綜合考慮實驗設(shè)備、技術(shù)手段、經(jīng)費預(yù)算等多方面因素,最常用的還是免疫組化、免疫熒光、膠原底物降解、明膠酶譜幾種方法。本研究分別采用免疫組化、明膠酶譜、Westernblot三種方法檢測MMP-2、MMP-9的活性,評價三種方法檢測MMP-2、MMP-9表達(dá)的優(yōu)點與局限性,為更加客觀準(zhǔn)確的反映各型腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的實際表達(dá),探討出一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的檢測手段。1材料和方法1.1手術(shù)切除新鮮組織選擇四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔頜面外科及四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科涎腺腫瘤患者手術(shù)切除新鮮組織,其中良性腫瘤26例(基底細(xì)胞腺瘤3例、肌上皮瘤3例、多形性腺瘤20例),惡性8例(黏液表皮樣癌、腺樣囊性癌各2例,腺泡細(xì)胞癌、惡性肌上皮瘤各1例,低分化腺癌2例)。排除復(fù)發(fā)涎腺腫瘤和術(shù)前曾接受抗腫瘤治療的患者。1.2方法1.2.1免疫組化sp法1.2.2明膠酶譜法1.2.3網(wǎng)絡(luò)盾1.3評估的結(jié)果1.3.1染色陽性細(xì)胞數(shù)參考Nagel的方法并加以改良進(jìn)行計分,無陽性細(xì)胞為陰性,記為0;染色陽性細(xì)胞數(shù)<10%記為1分;10%～50%記為2分;>50%記為3分。1.3.2檢測積分光密度4500000像素數(shù)碼照相機(jī)拍照,imageproplus4.10版本的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析,記錄積分光密度IOD。1.4統(tǒng)計方法以SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),采用Mann-Whitney檢驗和Logistic回歸分析。2結(jié)果2.1免疫組化2.2明膠酶譜2.3網(wǎng)絡(luò)盾2.4三種方法的結(jié)果的比較3活性mmps酶原蛋白及活性酶原活性分子的活性迄今為止,免疫組化方法仍是原位檢測組織蛋白最直觀、應(yīng)用最廣的方法,在檢測基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白的實驗中,它不僅提供了各型腫瘤間、各種因子間半定量的比較數(shù)據(jù),更重要的是做到了組織定位,從形態(tài)學(xué)上反映了MMPs的表達(dá)規(guī)律。如黏液表皮樣癌中MMPs主要表達(dá)在表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞,黏液細(xì)胞著色少;腺樣囊性癌中,條索狀實性區(qū)域上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于腺管-篩孔樣區(qū)域。根據(jù)組織學(xué)分級,黏液細(xì)胞分化相對成熟,而表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞分化較低,顯示了較強(qiáng)的生長活性。該結(jié)果支持Ross的結(jié)論:中間細(xì)胞是黏液表皮樣癌中最具侵襲性的細(xì)胞。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腺樣囊性癌中實性條索樣區(qū)域較腺管和篩孔樣區(qū)域浸潤性更強(qiáng),本研究中也顯示MMPs在這些區(qū)域中的表達(dá)更強(qiáng)。這些細(xì)胞定位特征提示了MMPs在涎腺惡性腫瘤浸潤、侵襲過程中的重要作用。但由于實驗中主觀因素干擾較多,如陽性信號的強(qiáng)弱受室溫、空氣濕度、溶液離子濃度等非控制因素的影響,各批次著色程度差異較大,另外陽性判斷也因主觀認(rèn)識不一而有所差異,故免疫組織化學(xué)只能對所檢測蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱進(jìn)行半定量比較。本實驗輔以Westernblot定量方法進(jìn)行補(bǔ)充,使設(shè)計更加嚴(yán)謹(jǐn),結(jié)果更加可信。明膠酶譜法是一種區(qū)分酶原和活性酶的特異性方法。MMP-2、MMP-9都是以酶原形式分泌,在細(xì)胞外環(huán)境中其N末端-肽段被切下來后即轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问健嶒炛羞\用非還原SDS電泳,利用MMPs與陰離子去垢劑SDS結(jié)合,形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,使待測蛋白質(zhì)帶上相同的負(fù)電荷,其量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別,此時蛋白質(zhì)分子在凝膠中的遷移率取決于其分子質(zhì)量。SDS電泳后,將分子量不同的MMPs及與MMPs結(jié)合的組織抑制劑同時分離,再用陽離子去垢劑(Trtion-X100)除去SDS,這一過程中引發(fā)了MMPs酶原蛋白體外活化機(jī)制,酶原在凝膠內(nèi)除掉一個約10×103KDa的小肽,轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?降解凝膠中相應(yīng)部位的明膠。體內(nèi)已被纖溶酶等物質(zhì)激活的活性MMPs,在除掉SDS后也可以恢復(fù)酶活性,在酶譜上稱之為活性型MMPs,可在比酶原分子量小10×103KDa處留下白色透明條帶,從而與酶原相區(qū)別?；钚悦冈隗w內(nèi)才具有水解膠原等基質(zhì)的作用,因而在功能上的意義要大于相應(yīng)的酶原。本研究免疫組化結(jié)果顯示惡性涎腺腫瘤中MMP-2的表達(dá)強(qiáng)于良性腫瘤,明膠酶譜實驗則進(jìn)一步證實是活性MMP-2表達(dá)不同導(dǎo)致這一差異,MMP-2酶原的分泌量在二者間差異是不明顯的,這也更加清晰的顯示在惡性腫瘤中MMP-2通過增加激活量促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。MMP-9在惡性涎腺腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)于良性腫瘤,但免疫組化實驗不能發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的差異。明膠酶譜法顯示:不僅活性MMP-9而且MMP-9酶原的分泌在二者也有重要差異,證實MMP-9同樣參與了腫瘤組織降解細(xì)胞外基質(zhì)、開辟浸潤、轉(zhuǎn)移通道的過程。此外,酶譜實驗還顯示了部分惡性涎腺腫瘤中中間型MMP-2的表達(dá),在MMP-2酶原的激活過程中,中間型MMP-2相當(dāng)于一個儲備庫,維持活性型MMP-2的高濃度,不因MMP-2酶原的量暫時變化而影響最終活性酶的濃度,維持了細(xì)胞外基質(zhì)的降解速率。本實驗在涎腺良性腫瘤中未發(fā)現(xiàn)中間型MMP-2表達(dá),而一些惡性腫瘤中能檢測到其存在,說明隨著涎腺惡性腫瘤持續(xù)生長,作為活性酶的儲備庫中間型MMP-2將不斷轉(zhuǎn)化為活性MMP-2,使活性酶持續(xù)增高或維持在一個相對較高的水平,令細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)降解。綜上所述,免疫組化、Westernblot、明膠酶譜三種方法結(jié)合既發(fā)揮了免疫組化細(xì)胞定位的優(yōu)勢,打破其不能辨別酶原與活性酶的局限性,又克服了免疫組化法半定量的局限性,能更加客觀準(zhǔn)確反映各型腫瘤組織中MMP-2、9的實際表達(dá),是一種可行的三聯(lián)檢測手段。將免疫組化所測的MMP-2計分值與Westernblot法測得的IOD值標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行比較,得到圖4的分布趨勢,Westernblot與免疫組化檢測的MMP-2表達(dá)強(qiáng)度一致。Westernblot是定量檢測,免疫組化是半定量檢測,二者趨勢一致說明免疫組化實驗所得數(shù)據(jù)是真實可信的。免疫組化實驗不能檢測出涎腺良惡性腫瘤間MMP-9的表達(dá)差異,明膠酶譜法不但能檢出總MMP-9的差異,還能檢出MMP-9酶原、活性MMP-9的差異。從圖5可以看出,MMP-2、MMP-9在涎腺良惡性腫瘤中表達(dá)不同主要是由于活性MMP-2、MMP-9表達(dá)不同所造成。受所購抗體適用范圍的限制,本實驗只對34例涎腺腫瘤進(jìn)行MMP-2的Westernblot檢測。得到的PVDF膜在相應(yīng)分子量區(qū)域(72KDa)見一條長方形棕黃色抗原條帶,即為所檢測的MMP-2組織蛋白條帶(圖3)。由于轉(zhuǎn)移過程中蛋白濃度減少,故膜上的顯色條帶較淺,肌上皮瘤、基底細(xì)胞腺瘤的有些條帶肉眼幾乎不能辨認(rèn),通過計算機(jī)成像分析才能檢測到。良惡性腫瘤間MMP-2的表達(dá)存在差異(P=0.029)。從上到下觀察得到的藍(lán)色背景凝膠塊,可以看到五條帶:分子量92KDa的MMP-9酶原;分子量83KDa的活性MMP-9;72KDa的MMP-2酶原;64KDa的中間型MMP-2,是去除了8KDa的肽段,但未完全激活,只有低分化腺癌(IOD值42570.91)、黏液表皮樣癌(IOD值32127.23)和腺樣囊性癌(IOD值41998.50)有所表達(dá);62KDa的活性MMP-2條帶(見圖2)。MMP-2酶原在全部樣本中都有較強(qiáng)表達(dá)(表2),良性、惡性腫瘤間差異不明顯(U=22.500,P=0.52)?；钚訫MP-2在所有樣本都有一定表達(dá),惡性腫瘤的表達(dá)水平高于良性腫瘤(U=9.500,P=0.011)。MMP-9酶原、活性MMP-9在大部分良性腫瘤中表達(dá)很低或缺失,在惡性腫瘤中均有明確表達(dá)(U=0.000、U=2.500,P=0.031、P=0.022)。部分低分化腺癌和腺樣囊性癌中,在MMP-2酶原和活性MMP-2帶間可見一條微弱的64KDa透明條帶,顏色較淺,即為中間型MMP-2。陽性信號呈棕色細(xì)顆粒狀,定位于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi),鏡下積分結(jié)果見表1。MMP-2在全部34例腫瘤中有不同程度表達(dá)(34/34),良性腫瘤中MMP-9呈陰性(肌上皮瘤1/3,基底細(xì)胞腺瘤2/3)。按前述標(biāo)準(zhǔn)計分后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)涎腺惡性腫瘤MMP-2的表達(dá)強(qiáng)于良性腫瘤(U=3.000,P=0.018);MMP-9在惡性腫瘤中的表達(dá)(均值1.556)也高于良性腫瘤(均值0.667),但二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=23.000,P=0.069)見圖1。黏液表皮樣癌中MMPs因腫瘤細(xì)胞種類不同而表達(dá)不同:表皮樣細(xì)胞和中間細(xì)胞表達(dá)較高(均值2),黏液細(xì)胞表達(dá)很少(均值1);腺樣囊性癌中MMPs在不同的組織結(jié)構(gòu)區(qū)域其表達(dá)也不相同:條索實性區(qū)域上皮細(xì)胞(均值2)表達(dá)強(qiáng)于腺管-篩孔樣區(qū)域(均值1.5)。單克隆抗體MMP-2、MMP-9,SP試劑盒購自ZYMED公司(1∶100)。3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波加熱抗原修復(fù),10%正常羊血清孵育,滴加一抗,4℃冰箱中過夜,PBS緩沖液(Na2HPO48.1mmol/L,KH2PO41.5mmol/L,NaCl137mmol/L,2.7mmol/LpH7.4)振蕩清洗后分別滴加二、三抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)封片。標(biāo)本離體后-70℃冰箱內(nèi)保存。常規(guī)勻漿、離心制備組織蛋白抽提液,提取上樣于含0.1%明膠的7.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS電泳,分子量Marker采用低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。電泳結(jié)束后將膠體置于洗脫液(2.5%TritonX-100)中震蕩洗滌;明膠緩沖液(50mM/LTris,100mM/LCaCl2,200mM/LNaCl,1μM/LZnCl2)37℃孵育18小時,此步驟為證實反應(yīng)產(chǎn)物確為MMP-2、MMP-9,可分別在明膠緩沖液中加入其非特異性抑制劑EDTA20mmol/L、特異性抑制劑苯甲基磺酰胺20mmol/L,以明確所得條帶的性質(zhì),同法孵育。孵育結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)溶液染色1小時,脫色約30～40分鐘,得到藍(lán)色背景上的透亮帶同明膠酶譜法制備組織蛋白抽提液,提取上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行還原性SDS電泳,半干