代謝組學(xué)的研究與應(yīng)用

代謝組學(xué)的研究與應(yīng)用

隨著人類科學(xué)研究項(xiàng)目的實(shí)施，闡明、序列遺傳因素和蛋白質(zhì)遺傳因素在人類生命周期研究中發(fā)揮著重要作用。與此同時，代謝遺傳因素（mei綜合征）出現(xiàn)并迅速發(fā)展，它們與基礎(chǔ)研究、序列研究和蛋白質(zhì)研究一起組成了“系統(tǒng)生物學(xué)”?；蚪M學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等各種“組學(xué)”在生命科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮了重要的作用,它們分別從調(diào)控生命過程的不同層面進(jìn)行研究,使人們能夠從分子水平研究生命現(xiàn)象,探討生命的本質(zhì),逐步系統(tǒng)地認(rèn)識生命發(fā)展的規(guī)律。這些“組學(xué)”手段加上生物信息學(xué),成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展是必要的,同時也是必須的。對于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中的缺點(diǎn)和不足,代謝組學(xué)正好可以進(jìn)行彌補(bǔ)。代謝組學(xué)研究的是生命個體對外源性物質(zhì)(藥物或毒物)的刺激、環(huán)境變化或遺傳修飾所做出的所有代謝應(yīng)答,并且檢測這種應(yīng)答的全貌及其動態(tài)變化。代謝組學(xué)方法為生命科學(xué)的發(fā)展提供了有力的現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,同時也為新藥臨床前安全性評價與實(shí)踐提供了新的技術(shù)支持與保障。1代謝組學(xué)的界定及其應(yīng)用代謝組學(xué)metabonomics最初是由英國帝國理工大學(xué)JeremyNicholson教授提出的,他認(rèn)為代謝組學(xué)是將人體作為一個完整的系統(tǒng),機(jī)體的生理病理過程作為一個動態(tài)的系統(tǒng)來研究,并且將代謝組學(xué)定義為生物體對病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)動態(tài)應(yīng)答的定量測定。2000年,德國馬普所的Fiehn等提出了metabolomics的概念,但是與Nicholson提出的metabonomics不同,他是將代謝組學(xué)定位為一個靜態(tài)的過程,也可以稱為“代謝物組學(xué)”,即對限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析。同時Fiehn還將代謝組學(xué)按照研究目的的不同分為4類:代謝物靶標(biāo)分析,代謝輪廓(譜)分析,代謝組學(xué),代謝指紋分析?，F(xiàn)在代謝組學(xué)在國內(nèi)外的研究都在迅速地發(fā)展,科學(xué)家們對代謝組學(xué)這一概念也進(jìn)行了完善,作出了科學(xué)的定義:metabonomics/metabolomics是對一個生物系統(tǒng)的細(xì)胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定性定量分析,從而定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學(xué)。與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)相同,代謝組學(xué)的主要研究思想是“全局觀點(diǎn)”。與傳統(tǒng)的代謝研究相比,代謝組學(xué)融合了物理學(xué)、生物學(xué)及分析化學(xué)等多學(xué)科知識,利用現(xiàn)代化的先進(jìn)的儀器聯(lián)用分析技術(shù)對機(jī)體在特定的條件下整個代謝產(chǎn)物譜的變化進(jìn)行檢測,并通過特殊的多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究整體的生物學(xué)功能狀況。由于代謝組學(xué)的研究對象是人體或動物體的所有代謝產(chǎn)物,而這些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都是由機(jī)體的內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成的,因此,代謝產(chǎn)物的變化也就揭示了內(nèi)源性物質(zhì)或是基因水平的變化,這使研究對象從微觀的基因變?yōu)楹暧^的代謝物,宏觀代謝表型的研究使得科學(xué)研究的對象范圍縮小而且更加直觀,易于理解,這點(diǎn)也是代謝組學(xué)研究的優(yōu)勢之一。代謝組學(xué)的優(yōu)勢主要包括:對機(jī)體損傷小,所得到的信息量大,相對于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)檢測更加容易。由于代謝組學(xué)發(fā)展的時間較短,并且由于代謝組學(xué)的分析對象是無偏向性的樣品中所有的小分子物質(zhì),因此對分析手段的要求比較高,在數(shù)據(jù)處理和模式識別上也不成熟,存在一些不足之處。同時生物體代謝物組變化快,穩(wěn)定性較難控制,當(dāng)機(jī)體的生理和藥理效應(yīng)超敏時,受試物即使沒有相關(guān)毒性,也可能引起明顯的代謝變化,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。代謝組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域大致可以分為以下7個方面:(1)植物功能基因組研究,主要以擬南芥為研究模型,也包括一些轉(zhuǎn)基因作物的研究;(2)疾病診斷,根據(jù)代謝物特征圖譜診斷腫瘤、糖尿病等疾病;(3)制藥業(yè)即新藥臨床前安全性評價,主要通過高通量比對預(yù)測藥物的毒性和有效性,通過全面分析來發(fā)現(xiàn)新的生物指示劑;(4)微生物領(lǐng)域;(5)毒理學(xué)研究,包括利用代謝組學(xué)平臺研究環(huán)境毒理及藥物毒理;(6)食品及營養(yǎng)學(xué),即研究食品中進(jìn)入體內(nèi)的營養(yǎng)成分及其與體內(nèi)代謝物的相互作用;(7)在中藥現(xiàn)代化及其機(jī)理上的研究。2生物代謝的特征代謝組學(xué)的研究過程一般包括代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識別和途徑分析等步驟。首先,采集生物樣品(如尿液、血液、組織、細(xì)胞和培養(yǎng)液等),對其進(jìn)行生物反應(yīng)滅活、預(yù)處理。再運(yùn)用先進(jìn)的分析手段如核磁共振、質(zhì)譜或色譜等檢測樣品中所有代謝物的種類、含量、狀態(tài),從而得到原始的大量的反映生物樣品信息的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),而后使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘,從這些復(fù)雜大量的信息中篩選出最主要的最能反映代謝物變化的主要成分,再通過模式識別將其與標(biāo)準(zhǔn)的代謝物譜進(jìn)行比對,或是根據(jù)代謝物譜在時程上的變化來尋找生物標(biāo)記物,研究相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī)律,以闡述生物體對相應(yīng)刺激的響應(yīng)機(jī)制。同時由于不同分析手段各有其特點(diǎn),在不同應(yīng)用領(lǐng)域使用的分析方法也是有所不同的。2.1nmr檢測靈敏度和高效性核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)是有機(jī)結(jié)構(gòu)測定的四大譜學(xué)之一,作為一種分析物質(zhì)的手段,由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品,并具有迅速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。在代謝組學(xué)發(fā)展的早期,NMR技術(shù)被廣泛應(yīng)用在毒性代謝組學(xué)的研究中。NMR的優(yōu)勢在于能夠?qū)悠穼?shí)現(xiàn)無創(chuàng)性、無偏向的檢測,具有良好的客觀性和重現(xiàn)性,樣品不需要煩瑣處理,具有較高的通量和較低的單位樣品檢測成本。此外,1H-NMR對含氫化合物均有響應(yīng),能完成樣品中大多數(shù)化合物的檢測,滿足代謝組學(xué)中的對盡可能多的化合物進(jìn)行檢測的目標(biāo)。NMR雖然可對復(fù)雜樣品如尿液、血液等進(jìn)行非破壞性分析,與質(zhì)譜法相比,它的缺點(diǎn)是檢測靈敏度相對較低(采用現(xiàn)有成熟的超低溫探頭技術(shù),其檢測靈敏度在納克級水平)、動態(tài)范圍有限,很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物;同時,購置儀器所需的投資也較大。為了改進(jìn)NMR檢測靈敏度較低的缺點(diǎn),可采用高分辨核磁共振技術(shù)或使用多維核磁共振技術(shù)和液相色譜-核磁共振聯(lián)用(LC-NMR)。魔角旋轉(zhuǎn)(magicanglespinning,MAS)核磁共振技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種新型的核磁共振技術(shù),在代謝組學(xué)的研究中,魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜技術(shù)已被成功地應(yīng)用到研究生物組織上,因?yàn)樯锝M織在核磁共振實(shí)驗(yàn)中會由于磁化率不均勻、分子運(yùn)動受限等因素而引起譜線增寬。這些因素利用固體核磁共振中的MAS方法可以消除。例如大鼠肝臟、哺乳動物腎臟以及大鼠睪丸組織等。2.2gc-ms和ms的聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)的研究中,氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)在植物代謝組學(xué)、診斷代謝組學(xué)、藥物毒理等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。有研究表明,采用GC-MS來檢測大鼠尿樣中內(nèi)源性的代謝產(chǎn)物可以檢測出49種,并且有26種代謝產(chǎn)物的檢測可以達(dá)到定量標(biāo)準(zhǔn)。GC-MS在植物代謝組學(xué)的研究中最為廣泛。它的優(yōu)勢在于能夠提供較高的分辨率和檢測靈敏度,并且有可供參考、比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫,可以方便地得到待分析代謝組分的定性結(jié)果。局限性表現(xiàn)在GC只能對其中的揮發(fā)性組分實(shí)現(xiàn)直接分析,從而得不到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息。如陸益紅等利用GC-MS技術(shù)探討自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)血漿代謝組差異,確證高血壓模型,在此基礎(chǔ)上探討人參總皂苷對SHR血壓及代謝組的影響,應(yīng)用GC-MS測定內(nèi)源性代謝物,用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)鑒別兩組動物的代謝譜及引起高血壓的生物標(biāo)記物。GC-MS聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)的其他方面的應(yīng)用也很廣泛,如王曉艷等對冷應(yīng)激及其藥物干預(yù)的代謝組學(xué)進(jìn)行研究。采用衍生化GC-MS的方法分析尿液中內(nèi)源性小分子代謝物,結(jié)合主成分分析、最小二乘法等模式識別方法計(jì)算峰響應(yīng)信號,冷應(yīng)激前后正常大鼠尿液內(nèi)源性代謝物在主成分分析圖上產(chǎn)生顯著分離,人參皂苷組則冷應(yīng)激前后幾乎無分離。從代謝物的角度證實(shí)冷應(yīng)激對動物機(jī)體的影響、機(jī)體的自我恢復(fù)以及人參皂苷的抗應(yīng)激作用。2.3采用lc-ms方法進(jìn)行代謝組學(xué)代謝組學(xué)研究所用到的三大分析技術(shù)中,液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)可以說是最晚在代謝組學(xué)領(lǐng)域得到開發(fā)與利用的,由于LC-MS聯(lián)用技術(shù)本身的強(qiáng)大優(yōu)勢,及其與NMR技術(shù)和GC-MS聯(lián)用技術(shù)的互補(bǔ)性,雖然起步較晚,但它的發(fā)展速度及應(yīng)用頻率正在大大提高中。LC-MS和GC-MS聯(lián)用技術(shù)都可以同時檢測出數(shù)百種化合物,包括糖類、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸和大量植物的次級代謝產(chǎn)物。但是GC-MS技術(shù)需要先對樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理,這一步驟耗時而且容易引起樣品的變化。而LC-MS技術(shù)不受此限制,其與NMR相比又具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)點(diǎn),適用于那些熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)、不易衍生化和相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)。在代謝組學(xué)的研究中,LC-MS已經(jīng)廣泛應(yīng)用在疾病診斷[15,16,17,18,19,20,21]、毒理學(xué)分析、中藥機(jī)理方面研究、植物代謝組學(xué)、物種差異的研究以及微生物代謝物研究等方面。其中,尋找與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物是近年來代謝組學(xué)研究中的熱門領(lǐng)域,它主要是通過對待測樣品與對照樣品的LC-MS分析,從得到的色譜圖和質(zhì)譜圖中提取數(shù)據(jù),再應(yīng)用一系列的數(shù)據(jù)處理手段,如峰檢測、峰對齊、濾噪等等,將從LC-MS分析中得到的大量的復(fù)雜數(shù)據(jù)簡單化,這種被簡化后的數(shù)據(jù)所呈現(xiàn)出的譜圖很容易就能觀察到樣品之間的差異。而為了能夠更加清晰地識別這種差異,通常采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法,應(yīng)用特殊的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,對大批量的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,在應(yīng)用LC-MS進(jìn)行代謝組學(xué)的研究中通常使用的是主成分分析法PCA和偏最小二乘法PLS。這樣經(jīng)過軟件的數(shù)據(jù)分類與特殊離群點(diǎn)的尋找等過程,就可以輕松地發(fā)現(xiàn)造成不同樣品組差異聚類的原因。根據(jù)MS的信息及與NMR技術(shù)的聯(lián)用就能夠確認(rèn)這些生物標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在代謝組學(xué)中尋找與疾病、毒性相關(guān)的生物標(biāo)記物對臨床應(yīng)用具有重要意義,比如支持疾病的臨床診斷和預(yù)后評估,建立毒性評價系統(tǒng)等等。在代謝組學(xué)的研究中,采用LC-MS分析手段與NMR、GC-MS技術(shù)有其相同之處,也有其特殊的地方。它的分析對象主要是尿樣、血漿和血清。針對不同的樣品,處理方法也是不同的。尿樣一般都是經(jīng)過12000～16000r·min-1的高速離心,將尿液中的微粒去除,吸取上清液稀釋,過0.22μm的濾膜后即可進(jìn)樣分析。由于尿樣中含有一定量的高分子物質(zhì),因此尿樣一定要離心、過濾后才能進(jìn)樣,同時稀釋樣品可以起到降低復(fù)雜基質(zhì)對分析結(jié)果的影響。同時有文獻(xiàn)表明,在對尿樣進(jìn)行稀釋時所使用的溶劑對LC-MS得到的結(jié)果也存在一定的影響。在該文獻(xiàn)中采用3種不同的方式處理尿樣,分別為不稀釋尿樣、用水稀釋尿樣及用甲醇稀釋尿樣,最后通過比較圖譜發(fā)現(xiàn)使用水對樣品進(jìn)行稀釋后使信號降低,檢測出的色譜峰減少,而用甲醇稀釋重復(fù)性好,因此用甲醇處理更適合對某類性質(zhì)相似的物質(zhì)代謝組學(xué)的分析,而不進(jìn)行稀釋處理樣品可能適用于全面廣泛的代謝組學(xué)研究。雖然不進(jìn)行樣品稀釋得到的結(jié)果較好,但是并不能忽視高分子如蛋白質(zhì)、某些鹽類對LC-MS的影響,可能會造成保留時間的遷移,而采用超高效液相色譜(UPLC)法可以降低基質(zhì)效應(yīng),保留時間遷移減小。在尿樣的處理中還可以應(yīng)用固相萃取(SPE)技術(shù)和親和色譜的方法對樣品中某些特殊性質(zhì)的成分進(jìn)行提取,如采用苯基硼酸親和凝膠色譜法提取尿樣中的核苷。采用SPE方法對人的尿液和貓的尿液進(jìn)行萃取,具有快速、簡便的特點(diǎn)。針對血漿及血清樣品的處理,一般是將血液放入加入抗凝劑或是不加入抗凝劑的試管中,通過低速離心(3000～4000r·min-1)后,得到血漿或是血清樣品,需要注意的是血清樣品一般要在室溫下放置1～2h后再離心。最后加入有機(jī)溶劑甲醇或乙腈沉淀蛋白,低溫高速離心后吸取上清液進(jìn)樣分析。生物樣品的儲存條件對代謝組學(xué)分析存在一定的影響,生物樣品在LC-MS自動進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性為4℃存在20h,在-20℃條件下可以穩(wěn)定存在1個月,同時樣品經(jīng)過9次凍融循環(huán)后就可造成樣品發(fā)生小部分變性。在采用LC-MS方法對樣品進(jìn)行分析處理及采集數(shù)據(jù)時,流動相的組成、梯度洗脫程序、運(yùn)行時間、每一針之間的污染等問題都可能對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理造成影響。關(guān)于流動相的組成一般采用的乙腈-水的體系,在其中添加一定比例的緩沖鹽有利于改善峰形,可以加入甲酸/甲酸銨或是醋酸/醋酸銨,甲酸銨主要在質(zhì)譜方面應(yīng)用廣泛,而采用醋酸銨可以提高結(jié)果的重現(xiàn)性。調(diào)節(jié)pH可以改善色譜峰的脫尾現(xiàn)象。除流動相的組成外,由于代謝組學(xué)要求分析的是“全體”代謝產(chǎn)物,因此一般會采用梯度洗脫程序,通過對一步梯度、曲線梯度、線性梯度的考察,發(fā)現(xiàn)一步梯度得到的色譜峰分離度較好,數(shù)量多;線性梯度在3種方式中得到的色譜峰數(shù)是最少的,而曲線梯度得到的圖譜保留時間有一定的遷移。梯度洗脫程序的運(yùn)行時間也對結(jié)果有影響,在陽離子檢測模式下,隨著運(yùn)行時間的延長,檢測到的色譜峰變多,峰變窄,但是日間變異率也增大;流速低得到的日間變異率也低。這說明延長運(yùn)行時間可以優(yōu)化分離度,增加靈敏度;降低流速可以得到更多的可重復(fù)的特征峰。由于代謝組學(xué)分析樣品的數(shù)量較大,因此為防止在自動進(jìn)樣時樣品之間的交叉污染,要在進(jìn)樣之間進(jìn)行洗針,一般就是采用所用的流動相進(jìn)行洗針從而防止樣品間污染。在代謝組學(xué)中一般色譜柱的型號是內(nèi)徑3mm或4.6mm,粒徑從3μm到5μm,長度從50mm到250mm,色譜柱的選擇是根據(jù)分析樣品性質(zhì)的不同而確定的。在樣品處理及數(shù)據(jù)采集后是對大批量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,現(xiàn)在常用的是主成分分析PCA和偏最小二乘-顯著性分析(PLS-DA)聯(lián)合法。通過主成分分析得分圖可以用來說明數(shù)據(jù)群的分類聚集情況,載荷圖可以用來尋找在數(shù)據(jù)群分類時起到主要作用的化合物,再通過LC-MS方法對載荷點(diǎn)所對應(yīng)的保留時間和質(zhì)荷比進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,最終得到生物標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一般采用的軟件包括:①theShimadzuClass-VPversion6.10software,此軟件用來將數(shù)據(jù)變化為CSV格式,然后峰經(jīng)過一系列的對齊,歸一化后進(jìn)行主成分分析;②SIMCA-P(Version10.0.2;Umetrics,Sweden),此軟件可進(jìn)行PCA和PLS-DA分析;③MicromassMarkerLynxApplication,version4.0(Waters,Milford,MA,USA),此軟件可以進(jìn)行峰檢測和峰對齊。2.3.1uplc-tof-ms的聯(lián)用方法超高效液相色譜(ultraperformanceliquidchromatography,UPLC)是指一種采用小顆粒填料色譜柱(粒徑小于2μm)和超高壓系統(tǒng)(壓力大于105kPa)的新型液相色譜技術(shù),能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度,同時大大縮短分析周期。因此特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究。UPLC與MS、MSn等設(shè)備的聯(lián)用技術(shù)發(fā)展很快,現(xiàn)已成功應(yīng)用于農(nóng)藥殘留物檢測、水質(zhì)和環(huán)境監(jiān)測、化妝品質(zhì)量控制、藥物及制劑的分析檢測和質(zhì)量控制、中藥復(fù)雜組分分析及代謝組學(xué)等領(lǐng)域。UPLC是具有超高分離度、超高速度、超高靈敏度的HPLC。實(shí)驗(yàn)表明,與傳統(tǒng)的HPLC相比,UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜(ultraperformanceliquidchromatography-timeofflightmassspectrum,UPLC-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種對分析復(fù)雜樣品很有效的方法。在分析尿樣時由于其中數(shù)以千計(jì)的代謝產(chǎn)物大部分為結(jié)構(gòu)完全未知的化合物。對于它們的鑒定,最好是采用柱后收集的方法得到一定量的純品,然后通過NMR、紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、MS等多種方法的協(xié)作來確定其結(jié)構(gòu),UPLC-TOF/MS的分離分析平臺可以提供有關(guān)化合物的保留時間、精確質(zhì)量、MS/MS數(shù)據(jù)以及單波長(254nm)紫外吸收情況,經(jīng)過這些有用數(shù)據(jù)信息的合理分析與整理,可以得到化合物的分子式及相對分子質(zhì)量,再通過數(shù)據(jù)庫檢索可得到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。在代謝組學(xué)中,UPLC與TOF-MS的聯(lián)用技術(shù)被應(yīng)用到了多個領(lǐng)域中,包括疾病診斷、毒性研究等等,其中UPLC-TOF/MS在對中藥作用機(jī)理的研究中有廣泛的應(yīng)用,同時還能夠?qū)χ兴幍乃幮нM(jìn)行評價。LC與MS聯(lián)用時流速的設(shè)定要考慮到分析時間、質(zhì)譜系統(tǒng)的耐受性等因素,因此采用較低的流速可以不經(jīng)分流直接導(dǎo)入MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測。同時由于UPLC對復(fù)雜樣品的分離能力強(qiáng),而良好的分離可以降低MS檢測時的離子抑制效應(yīng)。UPLC固定相的種類對分析樣品的能力也有一定的影響,由于C18柱對脂溶性的物質(zhì)的保留相對較強(qiáng),對樣品的分析效率較低,因此采用C8和苯基柱分離效率要好,同時由于C8柱比苯基柱的選擇范圍要廣,因此C8柱最適合分析代謝組學(xué)中的血漿樣品。在分析尿樣等復(fù)雜生物樣品時,一般要采用梯度洗脫程序可以得到良好的分離結(jié)果。近年來有實(shí)驗(yàn)表明,柱溫箱的溫度提高或梯度洗脫程序升高也可以明顯改善分離效果,對峰形也有改善。這種高溫超高效液相色譜(HT-UPLC)由于提高了柱溫使流動相等溶劑更易揮發(fā),在MS檢測時可以得到更多的離子,分離效果也被大大提高。2.3.2在熱價組成結(jié)構(gòu)上的應(yīng)用親水作用色譜(hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)又稱為“反相反相色譜”或“含水正相色譜”,HILIC的洗脫是以化合物親水性增加的次序排列。在HILIC中,流動相中的有機(jī)組分是弱洗脫劑,水相是強(qiáng)洗脫劑。如此性質(zhì)不僅使之具有與反相色譜互補(bǔ)的選擇性,而且其流動相可以具有更高的揮發(fā)度,增加了LC-MS分析靈敏度,降低了分離的操作壓力。由于代謝產(chǎn)物經(jīng)常比母體化合物極性更強(qiáng),濃度更低,這使得利用反相LC-MS保留、分離與檢測這類物質(zhì)非常困難。不同于反相色譜選擇性的HILIC色譜柱對極性代謝產(chǎn)物的保留能力更強(qiáng),使得代謝產(chǎn)物較疏水性更強(qiáng)、濃度更高的母體藥物在色譜上有更長的保留時間,因而最大程度地?cái)[脫了在色譜圖前端發(fā)生的質(zhì)譜離子抑制現(xiàn)象的影響。在代謝組學(xué)的應(yīng)用中,HILIC正好與反相HPLC(reversedphase-HPLC,RP-HPLC)和UPLC相互補(bǔ)充。HILIC可以明顯改善極性物質(zhì)及離子性質(zhì)化合物的保留時間,增加MS的電離效率,流動相的黏度較低導(dǎo)致分離速度比反相LC(RPLC)要快。由于大鼠尿樣中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物有一些是極性較大的物質(zhì),而這些物質(zhì)在普通的RP-HPLC色譜柱上保留很弱或是沒有保留,因此親水作用色譜柱對RP-HPLC在極性物質(zhì)的保留上有互補(bǔ)作用。采用ZIC-HILICcolumn(3.5μm,2.1mm×100mm)對大鼠尿液進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在C18柱上保留差的物質(zhì)保留行為良好,同時出峰時間向后遷移,使色譜峰不再積壓在一起,使用HILIC柱的出峰順序與使用普通的C18柱的出峰順序是相反的,并且對中等極性的物質(zhì)改變不大,對脂溶性物質(zhì)不保留。由于HILIC和RP-HPLC分析對象的范圍是不同的,因此采用HILIC與RP-HPLC聯(lián)用技術(shù)對大鼠的尿液進(jìn)行特征圖譜分析,可以將尿液中全部極性范圍內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的分離分析,同時也擴(kuò)大了代謝組學(xué)尋找與疾病、毒理、藥理相關(guān)的生物標(biāo)記物的范圍。對于“組學(xué)”要求的無目標(biāo)性分析,這種HILIC和RPLC的聯(lián)用技術(shù)正好可以擴(kuò)大檢測化合物的數(shù)量。RPLC的分離主要是對非水性物質(zhì)的選擇性,要在RPLC上分析極性物質(zhì)往往要用大比例的水作為流動相或是在流動相中添加一定量的離子對試劑,這種方法會造成很多問題,如加大水相的比例可能會