代謝組學(xué)在生物體系中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在生物體系中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是經(jīng)過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)換組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新分支。這是在生物系統(tǒng)受刺激或中斷前后（例如，在特定基因變異或環(huán)境變化后）研究生物系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物光譜及其動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)。研究的主題主要是相對(duì)于。子質(zhì)量1000以下的內(nèi)源性小分子。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等其他組學(xué)相比,代謝組學(xué)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)基因和蛋白表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物水平得到放大;(2)代謝組學(xué)的研究不需進(jìn)行全基因組測(cè)序或建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫(kù);(3)代謝物的種類(lèi)遠(yuǎn)少于基因和蛋白的數(shù)目;(4)生物體液的代謝物分析可反映機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。通過(guò)代謝組學(xué)研究既可以發(fā)現(xiàn)生物體在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動(dòng)后的應(yīng)答不同,也可以區(qū)分同種不同個(gè)體之間的表型差異。代謝組學(xué)相關(guān)研究可追溯到始于上世紀(jì)70年代的代謝譜分析(metabolicprofiling),這類(lèi)代謝譜分析通常采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)對(duì)患者體液中代謝物進(jìn)行定性、定量分析及對(duì)疾病進(jìn)行篩選和診斷。這種在臨床上利用代謝譜分析診斷有關(guān)疾病的方法一直延用至今。1983年,荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究組織vanderGreef在國(guó)際上首先采用質(zhì)譜對(duì)尿中代謝指紋進(jìn)行研究,并陸續(xù)有不少科學(xué)家開(kāi)始應(yīng)用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)和核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)技術(shù)進(jìn)行代謝譜分析。90年代后,研究目標(biāo)主要集中在藥物在體內(nèi)的代謝等方面。1997年,Oliver提出了通過(guò)定量分析盡可能多的代謝產(chǎn)物評(píng)估酵母基因的遺傳功能及其冗余度的必要性,首次將代謝產(chǎn)物和生物基因的功能聯(lián)系起來(lái)。1999年,Nicholson等提出metabonomics的概念,將代謝組學(xué)定義為生物體對(duì)病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)應(yīng)答的定量測(cè)定。2000年,德國(guó)馬普所的Fiehn等提出了metabolomics的概念,將其定義為對(duì)限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析。在21世紀(jì)的前幾年,植物和微生物領(lǐng)域應(yīng)用色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的代謝組學(xué)研究,用metabolomics的較多;而在藥物研發(fā)和疾病研究等領(lǐng)域,用NMR以動(dòng)物體液或組織樣品為研究對(duì)象的,則用metabonomics較多。隨著研究的深入,現(xiàn)在對(duì)這兩個(gè)名詞的區(qū)分已越來(lái)越少,基本等同使用。其它高通量代謝產(chǎn)物的提取和分析代謝組學(xué)研究一般包括代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識(shí)別和途徑分析等步驟。生物樣品(如尿液、血液、組織、細(xì)胞和培養(yǎng)液等)采集后進(jìn)行生物反應(yīng)滅活、預(yù)處理。運(yùn)用核磁共振、質(zhì)譜或色譜等檢測(cè)其中代謝物的種類(lèi)、含量、狀態(tài)及其變化,得到代謝譜或代謝指紋,而后使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對(duì)獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘,并研究相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī)律,以闡述生物體對(duì)相應(yīng)刺激的響應(yīng)機(jī)制、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物。樣品采集與制備樣品的采集與制備是代謝組學(xué)研究的初始步驟也是最重要的步驟之一,代謝組學(xué)研究要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和合適的分析精度。首先需要采集足夠數(shù)量的樣本,從而可有效減少源于生物樣品個(gè)體差異對(duì)分析結(jié)果的影響,得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)樣品收集的時(shí)間、部位、種類(lèi)、樣本群體等應(yīng)給予充分考慮。在研究人類(lèi)樣本時(shí),還需考慮飲食、性別、年齡和地域等諸多因素的影響。此外,分析過(guò)程要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制,需要考察如樣本的重復(fù)性、分析精度、空白等。代謝產(chǎn)物的變化對(duì)分析結(jié)果有較大的影響,在處理生物樣本時(shí)要特別注意避免由于殘留酶活性或氧化還原過(guò)程降解代謝產(chǎn)物、產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。通常需對(duì)所收集樣品進(jìn)行快速淬滅(quenching)。滅活的方法很多,如液氮冷凍、酸處理等。在代謝組學(xué)研究中,根據(jù)研究對(duì)象、目的和采用的分析技術(shù)不同,所需的樣品提取和預(yù)處理方法各異。如采用NMR的技術(shù)平臺(tái),只需對(duì)樣品做較少的預(yù)處理即可以分析;采用MS進(jìn)行“全”成分分析技術(shù)時(shí),樣品處理方法相對(duì)簡(jiǎn)單,但不存在一種普適性的標(biāo)準(zhǔn)化方法。代謝產(chǎn)物通常用水或有機(jī)溶劑(如甲醇、己烷等)分別提取,獲得水提取物和有機(jī)溶劑提取物,從而把非極性相和極性相分開(kāi),以便進(jìn)行分析。對(duì)于代謝輪廓譜或靶標(biāo)分析,還需要做較為復(fù)雜地處理,如常用固相微萃取、固相萃取、親和色譜等預(yù)處理方法。用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時(shí),常常需要進(jìn)行衍生化,增加樣品的揮發(fā)性。由于特定的提取條件往往僅適合某些類(lèi)化合物,目前尚無(wú)一種能夠適合所有代謝產(chǎn)物的提取方法。應(yīng)該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法,并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。代謝組學(xué)研究在整個(gè)樣品處理和分析過(guò)程中,應(yīng)盡可能保留和體現(xiàn)樣品中代謝物的信息,生物樣品的收集、滅活、儲(chǔ)存、處理、儀器分析和數(shù)據(jù)處理等環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題已越來(lái)越引起研究者的重視。數(shù)據(jù)采集完成樣本的采集和預(yù)處理后,樣品中的代謝產(chǎn)物需通過(guò)合適的方法進(jìn)行測(cè)定。代謝組學(xué)分析方法要求具有高靈敏度、高通量和無(wú)偏向性的特點(diǎn),與原有的各種組學(xué)技術(shù)只分析特定類(lèi)型的化合物不同,代謝組學(xué)所分析的對(duì)象的大小、數(shù)量、官能團(tuán)、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理化學(xué)參數(shù)差異很大。由于代謝產(chǎn)物和生物體系的復(fù)雜性,至今為止,尚無(wú)一種能滿(mǎn)足上述所有要求的代謝組學(xué)分析技術(shù),現(xiàn)有的分析技術(shù)都有各自的優(yōu)勢(shì)和適用范圍。最好采用聯(lián)用技術(shù)和多種方法綜合分析。色譜、質(zhì)譜、NMR、毛細(xì)管電泳、紅外光譜、電化學(xué)檢測(cè)等分離分析手段及其組合都出現(xiàn)在代謝組學(xué)的研究中。其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法兼?zhèn)渖V的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異性,NMR特別是1H-NMR以其對(duì)含氫代謝產(chǎn)物的普適性而成為最主要的分析工具。NMR:NMR是當(dāng)前代謝組學(xué)研究中的主要技術(shù),NMR的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)悠穼?shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性、無(wú)偏向的檢測(cè),具有良好的客觀性和重現(xiàn)性,樣品不需要繁瑣處理,具有較高的通量和較低的單位樣品檢測(cè)成本。此外,1H-NMR對(duì)含氫化合物均有響應(yīng),能完成樣品中大多數(shù)化合物的檢測(cè),滿(mǎn)足代謝組學(xué)中的對(duì)盡可能多的化合物進(jìn)行檢測(cè)的目標(biāo)。NMR雖然可對(duì)復(fù)雜樣品如尿液、血液等進(jìn)行非破壞性分析,與質(zhì)譜法相比,它的缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低(采用現(xiàn)有成熟的超低溫探頭技術(shù),其檢測(cè)靈敏度在納克級(jí)水平)、動(dòng)態(tài)范圍有限,很難同時(shí)測(cè)定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物;同時(shí),購(gòu)置儀器所需的投資也較大。為了提高NMR技術(shù)的靈敏度,研究者們采用了增加場(chǎng)強(qiáng)、使用低溫探頭和微探頭的方法。針對(duì)分辨率的問(wèn)題,使用了多維核磁共振技術(shù)和液相色譜-核磁共振聯(lián)用(liquidchromatography-nuclearmagneticresonance,LC-NMR)。Daykin等采用色譜技術(shù),利用LC-NMR聯(lián)用對(duì)心血管疾病患者血中的脂蛋白代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。Nicholson研究小組采用近年新發(fā)展的魔角旋轉(zhuǎn)(magicanglespinning,MAS)技術(shù),讓樣品與磁場(chǎng)方向成54.17°旋轉(zhuǎn),從而克服了由于偶極耦合(dipolarcoupling)引起的線展寬、化學(xué)位移的各向異性。應(yīng)用MAS技術(shù),研究者能夠獲得高質(zhì)量的NMR譜圖,樣品中僅加入少量的D2O而不必進(jìn)行預(yù)處理,樣品量只需約10mg?；贜MR技術(shù)的代謝組學(xué)方法已廣泛地應(yīng)用于藥物毒性、基因功能以及疾病的臨床診斷。質(zhì)譜:相對(duì)于NMR靈敏度低、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍窄等弱點(diǎn),MS具有較高的靈敏度和專(zhuān)屬性,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)化合物的同時(shí)快速分析與鑒定。隨著質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的研究者將色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于代謝組學(xué)的研究。GC-MS方法的主要優(yōu)點(diǎn)包括較高的分辨率和檢測(cè)靈敏度,并且有可供參考、比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù),可以用于代謝產(chǎn)物定性。但是GC不能直接得到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息,對(duì)于揮發(fā)性較低的代謝產(chǎn)物需要衍生化處理,預(yù)處理過(guò)程繁瑣。GC-MS常用于植物和微生物代謝指紋分析,如Fiehn等采用GC/MS研究擬南芥(arabidopsis)的基因型及其表型的關(guān)系,Styczynski等對(duì)大腸桿菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了詳細(xì)的分析。LC-MS避免了GC-MS中繁雜的樣品前處理,由于其較高的靈敏度和較寬的動(dòng)態(tài)范圍,已被越來(lái)越多地用于代謝組學(xué)研究,它非常適合于生物樣本中復(fù)雜代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和潛在標(biāo)記物的鑒定。LC-MS的代謝組學(xué)研究通常采用反相填料、梯度洗脫程序,但對(duì)于體液樣品特別是尿樣,含有大量的親水性代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物在反相色譜上不保留或保留很弱。最近研究者們使用親水反應(yīng)色譜(hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)解決親水性物質(zhì)的弱保留問(wèn)題。新的分析技術(shù)如超高效液相色譜/高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)、毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、傅里葉變換離子回旋共振技術(shù)等也被用于代謝組學(xué)研究以提高代謝產(chǎn)物的檢測(cè)靈敏度和通量。我中心研究了一個(gè)柱切換二維液相系統(tǒng),采用2根液相色譜柱(反相色譜柱和親水作用色譜柱),通過(guò)閥切換實(shí)現(xiàn)了一次進(jìn)樣親水和疏水代謝產(chǎn)物的同時(shí)檢測(cè),解決了復(fù)雜生物樣品中親水和疏水性代謝產(chǎn)物的同時(shí)檢測(cè)問(wèn)題。數(shù)據(jù)預(yù)處理方法:由上述分析儀器導(dǎo)出的元數(shù)據(jù)(metadata),不能直接用于模式識(shí)別分析,還需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,將元數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于多變量分析(主要是模式識(shí)別)的數(shù)據(jù)形式。主要的數(shù)據(jù)預(yù)處理包括濾噪、重疊峰解析(deconvolution)、峰對(duì)齊、峰匹配、標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等。在實(shí)際操作中,并不是這些步驟都需要進(jìn)行,而是根據(jù)實(shí)際情況,只做幾種預(yù)處理。最后用于模式識(shí)別的數(shù)據(jù)為二維矩陣數(shù)據(jù)形式,行代表樣品或?qū)嶒?yàn)數(shù)目,列表示相應(yīng)的單個(gè)測(cè)定指標(biāo)(通常為代謝物的信號(hào)強(qiáng)度等)。廣泛應(yīng)用的濾噪技術(shù)是正交信號(hào)校正技術(shù)(orthogonalsignalcorrection,OSC)。與普通的譜圖濾噪技術(shù)不同,OSC濾掉與類(lèi)別判斷正交(不相關(guān))的變量信息,只保留與類(lèi)別判斷有關(guān)的變量,從而使類(lèi)別判別分析能集中在這些與類(lèi)別的判別相關(guān)的變量上,提高判別的準(zhǔn)確性。OSC等效于從數(shù)據(jù)中去除了額外的影響因素,因此該方法經(jīng)常用于易受環(huán)境因素影響的分析,例如在微量藥物引發(fā)的生化效應(yīng)中,分析結(jié)果經(jīng)常被研究對(duì)象的性別、飲食和其他環(huán)境因素所淹沒(méi),在這種情形下,應(yīng)用OSC能收到較好的效果?；谏V-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法,如流動(dòng)相組成的微小變化,梯度的重現(xiàn)性及柱溫的微小變化及其柱表面的狀態(tài)變化常導(dǎo)致保留時(shí)間的差異。為了利用色譜圖中所有可以識(shí)別的峰信息,需對(duì)譜圖實(shí)行峰匹配(或稱(chēng)峰對(duì)齊),使相同的代謝產(chǎn)物在生成的數(shù)據(jù)矩陣中由同一個(gè)變量表示,使各樣本的數(shù)據(jù)得到正確的比較。在過(guò)去的幾十年,研究者們已經(jīng)研究出了很多算法用以這個(gè)目的。具有代表性的工作如Nielsen等研究的相關(guān)優(yōu)化曲面算法。最近Jonsson等研究了一種基于GC-MS的代謝組學(xué)的策略。由于保留時(shí)間的重復(fù)性問(wèn)題,HPLC中的峰匹配要相對(duì)困難,我中心研究了可用于代謝輪廓分析和代謝組學(xué)研究的液相色譜的“多區(qū)域可變保留值窗口”的峰對(duì)齊算法,解決了基于色譜技術(shù)的代謝輪廓分析方法中的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法代謝組學(xué)得到的是大量的、多維的信息。為了充分挖掘所獲得數(shù)據(jù)中的潛在信息,對(duì)數(shù)據(jù)的分析需要應(yīng)用一系列的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。在代謝組學(xué)研究中,大多數(shù)是從檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物信息中進(jìn)行兩類(lèi)(如基因突變前后的響應(yīng))或多類(lèi)(如不同表型間代謝產(chǎn)物)的判別分類(lèi),以及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。數(shù)據(jù)分析過(guò)程中應(yīng)用的主要手段為模式識(shí)別技術(shù),包括非監(jiān)督(unsupervised)學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督(supervised)學(xué)習(xí)方法。非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法用于從原始譜圖信息或預(yù)處理后的信息中對(duì)樣本進(jìn)行歸類(lèi),并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來(lái),不需要有關(guān)樣品分類(lèi)的任何背景信息。該方法將得到的分類(lèi)信息和這些樣本的原始信息(如藥物的作用位點(diǎn)或疾病的種類(lèi)等)進(jìn)行比較,建立代謝產(chǎn)物與這些原始信息的聯(lián)系,篩選與原始信息相關(guān)的標(biāo)記物,進(jìn)而考察其中的代謝途徑。用于這個(gè)目的的方法無(wú)可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本,所以稱(chēng)為非監(jiān)督(unsupervised)學(xué)習(xí)方法。主要有主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)、非線性映射、簇類(lèi)分析等。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法用于建立類(lèi)別間的數(shù)學(xué)模型,使各類(lèi)樣品間達(dá)到最大的分離,并利用建立的多參數(shù)模型對(duì)未知的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。在這類(lèi)方法中,由于建立模型時(shí)有可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本,所以稱(chēng)為有監(jiān)督學(xué)習(xí)。這種方法經(jīng)常需要建立用來(lái)確認(rèn)樣品歸類(lèi)(防止過(guò)擬合)的確認(rèn)集(validationset)和用來(lái)測(cè)試模型性能的測(cè)試集(testset)。應(yīng)用于該領(lǐng)域的主要是基于PCA、偏最小二乘法(partialleastsquares,PLS)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的改進(jìn)方法,常用的有類(lèi)模擬軟獨(dú)立建模和偏最小二乘法-判別分析(PLS-discriminantanalysis,PLS-DA)。作為非線性的模式識(shí)別方法,人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(artificialneuronalnetwork,ANN)技術(shù)也得到廣泛應(yīng)用。PCA和PLS-DA是代謝組學(xué)研究中最常用的模式識(shí)別方法,這兩種方法通常以得分圖(scoreplot)獲得對(duì)樣品分類(lèi)的信息,載荷圖(loadingplot)獲得對(duì)分類(lèi)有貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)大小,從而用于發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的變量。此外,在數(shù)據(jù)處理和分析的各階段,對(duì)數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和模型的有效性驗(yàn)證也需引起足夠的重視。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)t-q-ms分析藥物研發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域,尤其是西方的藥物研發(fā)主要沿用靶向研發(fā)策略,致使90%的藥物僅對(duì)30%~50%的患者有效,即50%~70%的患者不但未從所接受的藥物治療中受益,反而要承擔(dān)其所帶來(lái)的副作用。代謝組學(xué)在疾病動(dòng)物模型(包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)的確證、藥物篩選、藥效及毒性評(píng)價(jià)、作用機(jī)制和臨床評(píng)價(jià)等方面有著廣泛的應(yīng)用。Nicholson研究小組利用基于NMR代謝組學(xué)技術(shù),在藥物毒性評(píng)價(jià)方面開(kāi)展了深入的工作,其研究表明采用代謝組學(xué)方法可判斷毒性影響的組織器官及其位點(diǎn),推測(cè)藥物相關(guān)作用機(jī)制,確定與毒性相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物;并在此基礎(chǔ)上可建立供毒性預(yù)測(cè)的專(zhuān)家系統(tǒng)以及毒物影響動(dòng)物內(nèi)源性代謝物隨時(shí)間的變化軌跡。英國(guó)(倫敦)帝國(guó)理工學(xué)院與6家制藥公司聯(lián)合組成的小組(theconsortiumformetabonomictoxicology,COMET)開(kāi)展的藥物毒性代謝組學(xué)研究項(xiàng)目,基于1H-NMR和模式識(shí)別技術(shù),在前3年利用大鼠和小鼠體液、組織的NMR圖譜,對(duì)147種典型藥物的肝腎毒性進(jìn)行了研究。通過(guò)檢測(cè)正常和受毒動(dòng)物體液和組織中代謝物的NMR譜,結(jié)合已知毒性物質(zhì)的病理效應(yīng)建立了第1個(gè)大鼠肝臟和腎臟毒性的專(zhuān)家系統(tǒng)。該專(zhuān)家系統(tǒng)分為3個(gè)獨(dú)立的級(jí)別可實(shí)現(xiàn)正常/異常的判別、對(duì)未知標(biāo)本進(jìn)行毒性或疾病的識(shí)別以及病理學(xué)的生物標(biāo)記物識(shí)別。COMET計(jì)劃的第2期工作于2005年底正式啟動(dòng),目標(biāo)是研究標(biāo)準(zhǔn)毒素的分子機(jī)制,進(jìn)而建立可預(yù)測(cè)性的構(gòu)效關(guān)系。Mally等對(duì)1HNMR代謝組學(xué)方法用于腎功能損傷標(biāo)記物的可行性進(jìn)行了研究。他們采用FeNTA或溴化鉀引起的兩種腎功能損傷小鼠模型,研究了4-羥基-2(E)-壬醛基-巰基尿酸作為腎功能損傷標(biāo)記物的可行性,結(jié)果表明1HNMR代謝組學(xué)方法可以用來(lái)指示腎功能損傷,但對(duì)氧化應(yīng)激無(wú)特異性;HNE-MA和其他的磷脂過(guò)氧化標(biāo)記物有很好的相關(guān)性,標(biāo)記物的類(lèi)型與病理?xiàng)l件有關(guān),尚未發(fā)現(xiàn)普適性的氧化應(yīng)激標(biāo)記物。疾病研究代謝組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用主要包括病變標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和預(yù)后的判斷。代謝組學(xué)最廣泛的應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)與疾病診斷、治療相關(guān)的代謝標(biāo)記物,通過(guò)代謝物譜分析得到的相關(guān)標(biāo)志物是疾病的分型、診斷、治療的基礎(chǔ)。目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道了代謝組學(xué)在疾病研究的應(yīng)用,如新生兒代謝紊亂、冠心病、膀胱炎、高血壓和精神系統(tǒng)疾病等。本課題組將所建立的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于重大疾病(如腫瘤、2型糖尿病、重型肝炎等)的病變標(biāo)記物研究中,建立了基于正相液相色譜/電噴霧線性離子阱質(zhì)譜方法,用于體液中磷脂的代謝輪廓譜分析。將該方法應(yīng)用于2型糖尿病和健康人進(jìn)行分類(lèi)研究,識(shí)別出4種可能的磷脂分子生物標(biāo)記物;研究了n-3型多烯脂肪酸二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenicAcid,DHA)對(duì)人類(lèi)JurkatE-6-1T細(xì)胞中膜脂筏和可溶膜區(qū)域中幾種主要磷脂組成的影響。結(jié)果表明,EPA或DHA能夠使脂酰鏈為n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)的磷脂含量顯著增加,揭示了PUFAs免疫抑制作用的分子機(jī)制[15,37,40,51,60,82,83,84,85,86]。本課題組還建立了基于固相萃取(solidphaseextraction,SPE)-HPLC的體液中核苷代謝輪廓分析方法,并將該方法應(yīng)用于腫瘤的研究中,建立了正常人和癌癥患者尿中核苷的排放水平和模式;比較了不同癌種之間排放水平的差異,檢測(cè)癌癥的敏感性均顯著高于目前已臨床應(yīng)用的腫瘤標(biāo)記物。同時(shí)在區(qū)分良惡性腫瘤、監(jiān)測(cè)手術(shù)和化療效果以及預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)等方面都有較好的價(jià)值。同時(shí)將基于LC-MS方法的代謝組學(xué)平臺(tái)應(yīng)用于肝病的研究中,實(shí)現(xiàn)了不同肝病患者與正常人進(jìn)行有效區(qū)分,肝癌診斷中肝炎和肝硬化患者的假陽(yáng)性率僅為7.4%。應(yīng)用于慢性乙型肝炎的急性發(fā)作樣本,診斷正確率為100%;并鑒定出1個(gè)傳統(tǒng)標(biāo)記物和4個(gè)新的標(biāo)記物。植物代謝組學(xué)植物代謝組學(xué)研究大多集中在代謝輪廓(metabolicprofiling)或代謝物指紋圖譜(metabolitefingerprinting)上。根據(jù)對(duì)象的不同,植物代謝組學(xué)的研究主要包括:(1)某些特定種類(lèi)(species)植物的代謝物組學(xué)研究。這類(lèi)研究通常以某一植物為對(duì)象,選擇某個(gè)器官或組織,對(duì)其中的代謝物進(jìn)行定性和定量分析;(2)不同基因型(genotypes)植物的代謝物組學(xué)表型研究。一般需要兩個(gè)或兩個(gè)以上的同種植物(包括正常對(duì)照和基因修飾植物),然后應(yīng)用代謝物組學(xué)對(duì)所研究的不同基因型的植物進(jìn)行比較和鑒別;(3)某些生態(tài)型(ecotypes)植物的代謝物組學(xué)。這類(lèi)研究通常選擇不同生態(tài)環(huán)境下的同種植物,研究生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)植物代謝物產(chǎn)生的影響;(4)受外界刺激后植物自身免疫應(yīng)答。植物代謝組學(xué)研究最具代表性的是Fiehn等的工作,他們用GC-MS對(duì)4種不同基因型的擬南芥中的433種代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)4種不同基因型的植物進(jìn)行分類(lèi),并找到了對(duì)其表型分類(lèi)起重要作用的代謝產(chǎn)物。我中心與中國(guó)科學(xué)院北京植物所合作,開(kāi)展了青蒿中萜類(lèi)物質(zhì)的代謝途徑的研究。建立了基于全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(comprehensivetwodimensionalgaschromatography-timeofflightmassspectrometry,GC×GC-TOFMS)的青蒿揮發(fā)油分離分析方法,對(duì)青蒿中揮發(fā)油的成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明揮發(fā)油主要由烷烴、單萜、單萜含氧衍生物、倍半萜、倍半萜含氧衍生物5部分組成。用全二維氣相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可從青蒿揮發(fā)油中鑒定出300多個(gè)化合物,并鑒定出了青蒿素代謝途徑中的重要中間產(chǎn)物。采用GC×GC-TOFMS方法對(duì)轉(zhuǎn)不同基因青蒿樣品進(jìn)行分析與定性,初步鑒定了將近100種萜類(lèi)物質(zhì)并找出普通植株與轉(zhuǎn)基因植株在代謝產(chǎn)物上的差異。利用氣相色譜-色譜火焰離子化檢測(cè)器(gaschromatography-flameionizationdetector,GC-FID)和GC/MS方法為主要手段,對(duì)不同生長(zhǎng)階段的青蒿代謝指紋譜進(jìn)行了研究,青蒿的5個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期(幼苗期、成苗期、現(xiàn)蕾前期、現(xiàn)蕾期和盛花期)可以得到很好的區(qū)分,并證實(shí)了青蒿素產(chǎn)生途徑中瓶頸的存在。微生物代謝組學(xué)第1篇微生物代謝組學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道了基于GC-MS技術(shù),通過(guò)分析脂肪酸、氨基酸和糖類(lèi)并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法監(jiān)測(cè)腸系膜明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖過(guò)程中的微生物污染。目前,代謝組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于微生物表型分類(lèi)、突變體篩選、代謝途徑及微生物代謝工程、發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化及微生物降解環(huán)境污染物等方面。Gao等研究了不同基因修飾下胞內(nèi)和胞外代謝物的變化規(guī)律與特點(diǎn),并比較了不同底物、不同菌株胞內(nèi)代謝物指紋譜的差異;考察了環(huán)境對(duì)微生物代謝的影響,得到不同條件下嗜堿乳酸菌胞內(nèi)氨基酸變化與發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量的關(guān)系;研究銅綠假單胞菌和大腸埃希菌在不同抗生素作用下三羧酸(tr