理學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)細(xì)胞工程

細(xì)胞工程的基本原理1

植物細(xì)胞工程2

微生物細(xì)胞工程4第三章細(xì)胞工程

動(dòng)物細(xì)胞工程3

第一節(jié)細(xì)胞工程的基本原理

一、細(xì)胞工程的內(nèi)容

（1）定義應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的方法，在體外條件下以細(xì)胞為基本單位進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖，或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁殖動(dòng)、植物個(gè)體，或獲得某種有用的物質(zhì)的過程。一、細(xì)胞工程的內(nèi)容根據(jù)其研究對(duì)象不同，分為植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程和微生物細(xì)胞工程。細(xì)胞是細(xì)胞工程操作的主要對(duì)象。原核細(xì)胞細(xì)菌、放線菌真核細(xì)胞酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體胚胎移植核移植微生物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞培養(yǎng)微生物細(xì)胞雜交二、發(fā)展史1838～1839年提出細(xì)胞學(xué)說；

1902年提出細(xì)胞全能性；

細(xì)胞全能性：植物細(xì)胞具有原植物的全部遺傳性，單細(xì)胞經(jīng)人工培養(yǎng)，通過細(xì)胞分裂而恢復(fù)成完整植株。

1904年用胡蘿卜胚培養(yǎng)成株，三十年代獲愈傷組織。

1948年發(fā)現(xiàn)腺嘌呤，生長素對(duì)芽形成的影響，建立腺嘌呤/生長素的比例控制芽根分化。二、發(fā)展史1956年發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素促芽形成效果高，促組培工作研究；

六十年代從曼陀蘿花藥培養(yǎng)獲植株建花培技術(shù)；

1972年細(xì)胞融合成功；

1912年培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞；

1958年獲細(xì)胞融合（種間、腹水癌細(xì)胞+病毒）

六十年代初換核術(shù)成功；

1975年獲雜交瘤；

我國70年代中開始細(xì)胞融合；

現(xiàn)有40多種花粉植株，在我國首次成功。三、細(xì)胞工程的基本操作無菌操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)1、無菌操作技術(shù)

細(xì)胞工程的所有實(shí)驗(yàn)都要求在無菌條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作成在無菌室內(nèi)進(jìn)行。無菌室應(yīng)定期用紫外線或化學(xué)試劑消毒，實(shí)驗(yàn)前后還應(yīng)各消毒一次。無菌室外有間緩沖室，實(shí)驗(yàn)人員在此換鞋、更衣、戴帽，做好準(zhǔn)備后方可進(jìn)入無菌室，操作時(shí)實(shí)驗(yàn)者的雙手應(yīng)戴無菌手套。注意周圍環(huán)境的衛(wèi)生整潔。生物材料、一切器械、器皿和藥品應(yīng)進(jìn)行滅菌或除菌。

無菌操作殺菌和消毒物理法化學(xué)試劑抗生素超凈工作臺(tái)2、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的保存和生長。雖然這些細(xì)胞培養(yǎng)在營養(yǎng)要求等方面有許多差異，但作為細(xì)胞培養(yǎng)，它們也有些共同之處。首先，要取材和除菌。除了淋巴細(xì)胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，動(dòng)物材料在取材前都要用一定的化學(xué)試劑進(jìn)行嚴(yán)格的表面清洗、消毒。有時(shí)還需要某些特定的酶對(duì)材料進(jìn)行頂處理，以期得到分散生長的細(xì)胞。其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培養(yǎng)基并進(jìn)行滅菌。將生物材料接種于培養(yǎng)基中，最后將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)應(yīng)及時(shí)收獲或傳代。3、細(xì)胞融合技術(shù)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細(xì)胞融合。細(xì)胞融合是細(xì)胞工程的重要基本技術(shù)，其主要過程包括：①制備原生質(zhì)體。由于微生物及植物細(xì)胞具堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，因此通常需用酶將細(xì)胞壁降解。動(dòng)物細(xì)胞則無此障礙。②誘導(dǎo)細(xì)胞融合。兩親本細(xì)胞(原生質(zhì)體)的懸浮液調(diào)至一定細(xì)胞密度；按1：1的比例混合后，用物理、化學(xué)或生物的方法促進(jìn)融合。③篩選雜合細(xì)胞。將上述混合液移到特定的篩選培養(yǎng)基上，讓雜合細(xì)胞有選擇地長出，其他未融合細(xì)胞無法生長。以獲得具有雙親遺傳特性的雜合細(xì)胞。細(xì)胞融合技術(shù)制備原生質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞融合化學(xué)法物理法生物法篩選雜合細(xì)胞

四、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、微生物細(xì)胞培養(yǎng)

2、植物細(xì)胞培養(yǎng)

3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

1、微生物細(xì)胞培養(yǎng)1）培養(yǎng)基的組成碳源氮源無機(jī)鹽維生素水1）培養(yǎng)基的組成碳源蔗糖、萄葡糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖或多糖類的可溶性淀粉、糊精及果膠；由其他谷物、馬鈴薯、紅薯、木薯等得到的糖類物質(zhì)。

作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓；

構(gòu)造微生物體；

參與新陳代謝。

注意:不同濃度影響細(xì)胞的增殖分化。1）培養(yǎng)基的組成氮源來源：無機(jī)氮源（氨氣、銨鹽或硝酸鹽等）和有機(jī)氮源（氨基酸、蛋白質(zhì)或尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等）。

作用：構(gòu)成微生物細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸的主要元素。細(xì)胞生長分化需氮。

1）培養(yǎng)基的組成

無機(jī)鹽大量元素：每升培養(yǎng)基含0.5毫摩爾以上。

微量元素：每升培養(yǎng)基含0.5毫摩爾以下。

大量元素：P、K、Mg、S、Ca等；

微量元素：鈷、銅、鐵、錳、鉬、鋅等。

作用：構(gòu)成菌體的組成；作為酶活性基團(tuán)的組成部分；調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的pH值。1）培養(yǎng)基的組成維生素維生素是生物體生長不可缺少的一種或數(shù)種極微量的有機(jī)物質(zhì)，但微生物在生長時(shí)，自身往往又缺乏合成這種有機(jī)物的能力，因此，必須由外界提供。與微生物關(guān)系較大的維生素，主要是B族維生素。作用：是微生物體內(nèi)各種酶活性基團(tuán)的組成部分。直接參與生物催化劑——酶的形成及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝。1）培養(yǎng)基的組成維生素C（抗壞血酸）：強(qiáng)還原能力，防組

織氧化變褐。

B1（硫胺素）：促愈傷組織產(chǎn)生，與愈傷

組織活力有關(guān)。

B2（煙酸或維生素PP）：促代謝，促胚的

發(fā)育，高濃度會(huì)抑制生長。

B6（吡哆醇）：促根生長。

肌醇（環(huán)己六醇）：無促進(jìn)生長的作用，

但有助活性物質(zhì)發(fā)揮作用。1）培養(yǎng)基的組成水培養(yǎng)基大部分是水

來源：不含或少含某些離子的重蒸水（雙蒸水）或去離子水。

目的：保持培養(yǎng)基成分完全人為控制。作用：起媒介作用

組成作物體（占75～80%）

提供O、H元素

運(yùn)輸物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透壓2）培養(yǎng)基的種類按成分不同劃分：

天然培養(yǎng)基：含有化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物。

合成培養(yǎng)基：由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。根據(jù)物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基2）培養(yǎng)基的種類按用途劃分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基（營養(yǎng)培養(yǎng)基）鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基其他培養(yǎng)基：分析培養(yǎng)基、還原性培養(yǎng)基等3）培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)；（2）液體培養(yǎng)；（3）連續(xù)培養(yǎng)；（4）中間補(bǔ)料培養(yǎng)；（5）同步培養(yǎng)；（6）混合培養(yǎng)。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)

廣義的植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的單個(gè)游離細(xì)胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng)，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。食品工業(yè)意義上的植物細(xì)胞培養(yǎng)主要是指細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，即使游離的植物細(xì)胞或一些小的細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中增殖并分離提取細(xì)胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞體系建立的一般程序?yàn)椋赫w植株株——植物組織或器官——外植體——在固體培養(yǎng)基上誘發(fā)愈傷組織——愈傷組織繼代培養(yǎng)——懸浮培養(yǎng)。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)基本操作過程：一般利用次亞氯酸鹽的稀溶液、酒精、升汞等消毒劑對(duì)合適的植物材料進(jìn)行表面消毒滅菌，在無面條件下切取未受損傷或未被污染的組織或器官(即外植體)，置于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨著細(xì)胞增殖形成不定型細(xì)胞團(tuán)(即愈傷組織)，將此愈傷組織移入新鮮固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)或轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。愈傷化時(shí)間隨植物種類和培養(yǎng)基條件不同而不同，慢的需要幾周以上，一旦增殖開始，就可反復(fù)繼代培養(yǎng)，加速細(xì)胞生殖。繼代培養(yǎng)可用試管或燒瓶等，大規(guī)模懸浮培養(yǎng)可用傳統(tǒng)的攪拌罐、氣式發(fā)酵罐。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比，具最大的優(yōu)點(diǎn)是植物細(xì)胞能在簡單的合成培養(yǎng)基上生長。其培養(yǎng)基的成分由無機(jī)鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機(jī)氮源、有機(jī)酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。包括植物生長所必需的16種營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞培養(yǎng)方法單細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)；固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（搖瓶懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模懸浮培養(yǎng)）。懸浮培養(yǎng)是指把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的無菌培養(yǎng)。2、植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)方法1）植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法2、植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)方法2）植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)

所謂固定化細(xì)胞培養(yǎng)，即把細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)，如瓊脂、藻酸鹽、聚丙烯酰胺、纖維或膜上面或里面，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，而營養(yǎng)液可以在細(xì)胞間流動(dòng)，供應(yīng)其營養(yǎng)。常用的細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)平床培養(yǎng)系統(tǒng)立柱培養(yǎng)系統(tǒng)3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指離散的動(dòng)物活細(xì)胞體外人工無菌條件下的生長增殖，在整個(gè)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。根據(jù)細(xì)胞是否貼附于支持物上生長的特性，培養(yǎng)的細(xì)胞可分為兩大類：懸浮型和貼附型。懸浮型細(xì)胞是指生長時(shí)呈懸浮狀態(tài)的細(xì)胞；貼附型是指貼附于支持物上生長的細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一般程序是：組織切碎-酶處理得單個(gè)細(xì)胞-培養(yǎng)-再擴(kuò)大培養(yǎng)。3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1）細(xì)胞培養(yǎng)基的組成氨基酸維生素鹽：鈉、鉀、鎂、鈣、氯等金屬離子和酸根離子葡萄糖有機(jī)添加劑激素和生長因素3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2）常用培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)3）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)法五、細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)是指在一定條件下，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合在一個(gè)細(xì)胞的過程，細(xì)胞融合又稱細(xì)胞雜交。五、細(xì)胞融合技術(shù)1.細(xì)胞融合的方法

生物學(xué)法化學(xué)融合劑法電處理融合法五、細(xì)胞融合技術(shù)2.微生物原生質(zhì)體的制備與融合

1）微生物原生質(zhì)體的制備為制備微生物的原生質(zhì)體，必須有效地去除細(xì)胞壁，根據(jù)各種微生物細(xì)胞壁的不同結(jié)構(gòu)和組成，可以用不同的方法來脫壁。目前，常用酶法來脫壁。五、細(xì)胞融合技術(shù)2.微生物原生質(zhì)體的制備與融合

1）微生物原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體制備之前，微生物細(xì)胞需經(jīng)過種子培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)到一定的對(duì)數(shù)生長期，其菌量約為菌懸浮液中4×l08個(gè)／mL時(shí)為宜，然后加溶菌酶在42℃輕輕振蕩45min即形成原生質(zhì)體，由于原生質(zhì)體對(duì)滲透壓敏感，因此在瓊脂培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，原生質(zhì)體會(huì)在低滲條件下破裂失活，不能形成菌落，曲落越少說明原生質(zhì)體化效果愈好。原生質(zhì)體形成率＝原生質(zhì)休數(shù)/未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)。五、細(xì)胞融合技術(shù)2.微生物原生質(zhì)體的制備與融合

2）微生物原生質(zhì)體融合和再生融合是把兩親本的原生質(zhì)體混合在一起，采用不同的方法進(jìn)行，最常用的是PEG融合和電融合。融合率＝融合子/兩親本原生質(zhì)體再生菌落的總數(shù)五、細(xì)胞融合技術(shù)3.植物原生質(zhì)體的制備

1）取材與除菌

2）酶解

3）分離

4）洗滌

5）鑒定五、細(xì)胞融合技術(shù)4.融合子的篩選

1）微生物融合子的篩選

2）植物融合子的鑒定

3）動(dòng)物細(xì)胞融合子的鑒定作業(yè)1.什么是細(xì)胞工程？2.植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法有哪些？第二節(jié)植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程：以植物細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為地精細(xì)操作，使細(xì)胞的一些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良品種或生產(chǎn)生物產(chǎn)品的目的的一種技術(shù)。植物細(xì)胞工程通常采用的技術(shù)手段

植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞的全能性：生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能的特性。

生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。脫分化：已分化（或成熟）的組織又恢復(fù)到無分化的初始狀態(tài)。

在組織培養(yǎng)過程中，將已經(jīng)分化的莖、葉、花等外植體進(jìn)行培養(yǎng)，使其形成愈傷組織，回復(fù)到?jīng)]有分化的狀態(tài)。再分化：在組織培養(yǎng)過程中，對(duì)處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其形成新的植物體的過程。外植體：在植物組織培養(yǎng)過程中，從植物體上被分離下來接種到培養(yǎng)基上，供培養(yǎng)用的原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織、器官等。

建立外植體的過程：從植物組織（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等）分離外植體→滅菌消毒→切取并將外植體接種于培養(yǎng)基上愈傷組織：在培養(yǎng)基中，外植體切口處不斷增殖產(chǎn)生的一團(tuán)不定形的薄壁組織就是愈傷組織。

愈傷組織可使傷口愈合，保護(hù)表面細(xì)胞；植物扦插時(shí)，愈傷組織可形成不定根；植物嫁接時(shí)，愈傷組織可使接穗和砧木愈合；在植物組織培養(yǎng)中，愈傷組織可形成不定芽或不定根。初代培養(yǎng)：在組織培養(yǎng)過程中，最初建立的外植體的無菌培養(yǎng)階段。繼代培養(yǎng)：在組織培養(yǎng)過程中，當(dāng)外植體被接種一段時(shí)間后，將已經(jīng)形成愈傷組織或已經(jīng)分化出根、莖、葉、花等的培養(yǎng)物重新切割，轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上以進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)的過程。試管苗：在無菌條件下的人工培養(yǎng)基上，對(duì)植物細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行培養(yǎng)所獲得的再生植株。

外植體愈傷組織新植株科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。一、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)：通過無菌操作分離植物體的一部分作為外植體，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下（包括培養(yǎng)條件、激素、溫度、光照、濕度等）進(jìn)行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株或者獲得次生代謝產(chǎn)物的過程。外植體愈傷組織新植株過程：初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)最終產(chǎn)品形式：試管苗或細(xì)胞代謝產(chǎn)物培養(yǎng)條件：光照、溫度、相對(duì)濕度應(yīng)用：試管苗的快速繁殖、無病毒植物的培育、提取次生代謝產(chǎn)物、人工種子的培育、轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)等。一、植物組織培養(yǎng)進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個(gè)階段：1外植體的選擇及培養(yǎng)。2誘導(dǎo)去分化階段。3繼代增殖階段。4誘導(dǎo)分化生根成芽階段。5移栽成活階段。離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細(xì)胞的再分化。植物組織培養(yǎng)過程離體植物細(xì)胞愈傷組織胚狀體根芽植物體脫分化再分化

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例（一）

紫草紫草素

愈傷組織

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例（二）胚狀體人工種皮人工胚乳

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用舉例（三）人工種子二、植物細(xì)胞培養(yǎng)

在離體條件下，將愈傷組織或者其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)。三.植物細(xì)胞雜交（細(xì)胞融合）1960年英國諾丁漢大學(xué)Cocking教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體,開辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。植物細(xì)胞雜交的主要過程：1.原生質(zhì)體的制備。2.原生質(zhì)體的融合。3.雜合體的鑒別與篩選。植物A細(xì)胞植物B細(xì)胞去壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合融合體再生壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株去壁的常用方法：酶解法（纖維素酶、果膠酶等）

原生質(zhì)體融合方法：物理法：離心、振動(dòng)、電刺激等化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）植物體細(xì)胞雜交

過程(1)(1)(2)(3)(4)(5)

植物體細(xì)胞雜交過程示意圖白菜甘藍(lán)白菜－甘藍(lán)植物體細(xì)胞雜交應(yīng)用作業(yè)1.什么是植物細(xì)胞工程？2.簡述植物組織培養(yǎng)的幾個(gè)階段。第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程是由多個(gè)學(xué)科綜合組成的新興技術(shù)。相關(guān)學(xué)科：基礎(chǔ)生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、化學(xué)工程學(xué)、應(yīng)用物理、電子計(jì)算機(jī)等第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用：生產(chǎn)基因工程藥物、單克隆抗體、疫苗等。主要特點(diǎn)：以工業(yè)化為目的，應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理，研究生物活細(xì)胞為主體的生物反應(yīng)過程，解決動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中帶有共性和特性的工程技術(shù)問題。動(dòng)物細(xì)胞工程通常采用的技術(shù)手段

動(dòng)物細(xì)胞融合所采用技術(shù)的理論基礎(chǔ)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體胚胎移植核移植細(xì)胞增殖全息胚學(xué)說第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程培養(yǎng)條件：適宜的溫度、pH、溶解氧水平動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)（1）原代培養(yǎng)：以動(dòng)物胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織為材料，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液，放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）傳代培養(yǎng)：隨著細(xì)胞的生長和增殖，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞越來越多，需要定期地用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞株無限傳代細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液細(xì)胞株細(xì)胞系細(xì)胞增殖無限傳代去掉組織間蛋白動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系注意界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株和細(xì)胞系多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)分裂10次細(xì)胞株傳代培養(yǎng)分裂50次(細(xì)胞系)(細(xì)胞株)細(xì)胞系無限分裂遺傳物質(zhì)未發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變無限增殖有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的幾個(gè)問題（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動(dòng)物血清等（動(dòng)物體細(xì)胞大都生活在液體的環(huán)境）

血清是一種很好的營養(yǎng)物質(zhì)，含有動(dòng)物體細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，并給動(dòng)物創(chuàng)造了生活環(huán)境。

任何血清使用前必須經(jīng)過鑒定，只有無菌、無內(nèi)毒素、無溶血或低溶血、蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)素達(dá)一定標(biāo)準(zhǔn)以上才能使用。

血清與血漿的主要區(qū)別是血清里不含纖維蛋白原。（2）為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？

因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)。（3）為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？

成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？

不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體貼壁生長

大多數(shù)組織細(xì)胞不適應(yīng)懸浮生長，必須在固定的表面生長和分裂。脫離下來

當(dāng)表面相互接觸時(shí)就停止分裂增殖——接觸抑制

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮。（3）用于檢測有毒物質(zhì)（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)培養(yǎng)結(jié)果獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白培養(yǎng)目的動(dòng)物血清液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞的全能性原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體分泌蛋白快速繁殖、培育無病毒植株葡萄糖蔗糖植物激素培養(yǎng)基特有成分細(xì)胞的增殖植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較二、動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺(tái)病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核動(dòng)物細(xì)胞融合的意義（1）克服植物遠(yuǎn)緣雜交不親和性。（2）擴(kuò)大遺傳重組范圍、增加變異、創(chuàng)造新品種。（3）單克隆抗體的生產(chǎn)。誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法物理法：離心、振動(dòng)、電刺激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）生物法：滅活的動(dòng)物病毒（喪失感染活性）主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性細(xì)胞融合的原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目植物、動(dòng)物細(xì)胞融合的比較動(dòng)物細(xì)胞融合最重要的用途制備單克隆抗體抗原吞噬細(xì)胞T細(xì)胞B細(xì)胞增殖、分化效應(yīng)B細(xì)胞T記憶細(xì)胞B記憶細(xì)胞抗體抗原殺滅結(jié)合增殖增殖、分化效應(yīng)T細(xì)胞靶細(xì)胞接觸、激活溶酶體酶靶細(xì)胞解體死亡增殖淋巴因子增強(qiáng)免疫細(xì)胞作用再次進(jìn)入長期以來，為了獲得抗體，采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動(dòng)物體內(nèi)，然后從動(dòng)物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。人們發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B細(xì)胞可以產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每個(gè)B細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，即克隆。用單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行克隆，得到的細(xì)胞群能夠分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體，這種抗體叫做單克隆抗體。（1）提出問題：從動(dòng)物血清中分離抗體的方法產(chǎn)量低、特異性差、純度低、反應(yīng)不夠靈敏單克隆抗體

（2）設(shè)計(jì)方案：由于每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，利用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，就可以產(chǎn)生單克隆抗體。

由于B淋巴細(xì)胞不能無限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與之融合，就可達(dá)到目的。

單克隆抗體制備過程：

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體（選擇性培養(yǎng)基）選擇性培養(yǎng)基：使親本細(xì)胞不能存活而雜種細(xì)胞可存活本過程利用了免疫原理，細(xì)胞融合原理和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合，這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體。

細(xì)胞的同源性越近，融合形成的雜種細(xì)胞越易成活有無限增殖能力（失去凋亡機(jī)制，失去接觸抑制等）的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，而具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞，稱為癌細(xì)胞。單克隆抗體的應(yīng)用①在基礎(chǔ)理論研究中具有重要意義②在疾病診斷、治療和預(yù)防方面，具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)越性。③生物導(dǎo)彈（作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤）

目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計(jì)的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個(gè)必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。資料小結(jié)兩個(gè)過程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個(gè)“一”一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法－－滅活病毒一個(gè)新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞一個(gè)優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢三、細(xì)胞核移植技術(shù)細(xì)胞核移植，就是將一個(gè)細(xì)胞核用顯微注射的方法放進(jìn)另一個(gè)細(xì)胞里去。供體——胚胎的干細(xì)胞核；體細(xì)胞的核受體——多是動(dòng)物的卵子用途——細(xì)胞核移植技術(shù)只要用于研究胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的功能，以及二者的關(guān)系；探討有關(guān)遺傳、發(fā)育和細(xì)胞分化等方面的基本理論問題。多莉羊的培育過程細(xì)胞核移植卵細(xì)胞C母綿羊子宮Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵細(xì)胞細(xì)胞拆合技術(shù)妊娠黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多莉

采用此方法可以將兩個(gè)不同種、屬的動(dòng)物優(yōu)點(diǎn)集中在一起，產(chǎn)生具有雙親優(yōu)點(diǎn)的可繁殖的雜種動(dòng)物。

細(xì)胞核移植對(duì)動(dòng)物優(yōu)良雜交種的無性繁殖具有重大意義。這一技術(shù)的成功與完善對(duì)于優(yōu)良家禽的無性繁殖和瀕臨絕跡的珍貴動(dòng)物的傳種意義重大?？寺?dòng)物的研究意義1.用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2.改良動(dòng)物品種3.治療人類疾病4.保護(hù)瀕危動(dòng)物四、動(dòng)物的胚胎移植

解決某些妊娠時(shí)間長、每胎產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)良種畜的繁殖速度問題。（1）激素促多排卵（2）體外受精（3）培育胚胎（4）胚胎激素處理（5）胚胎植入母體操作過程胚胎移植技術(shù)試管動(dòng)物（嬰兒）培養(yǎng)過程：卵細(xì)胞精子體外受精受精卵胚胎新個(gè)體母體子宮內(nèi)孕育、產(chǎn)出①植物組織培養(yǎng)是植物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。②動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是各種動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。③為達(dá)到特定的目的，許多細(xì)胞工程技術(shù)往往需要同時(shí)運(yùn)用。不同細(xì)胞工程技術(shù)間的關(guān)系作業(yè)1.什么是單克隆抗體？主要應(yīng)用是什么？2.簡述動(dòng)物細(xì)胞融合與植物細(xì)胞融合的異同。第四節(jié)微生物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程：應(yīng)用微生物細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平的研究和生產(chǎn)，具體內(nèi)容包括各種微生物細(xì)胞的培養(yǎng)、遺傳性狀的改變、微生物細(xì)胞的直接利用或獲得細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。一、微生物原生質(zhì)體融合用水解酶除去微生物細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體，然后用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩個(gè)親本原生質(zhì)體形成一個(gè)細(xì)胞，經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交的目的，經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子，這個(gè)過程就稱為微生物原生質(zhì)體融合。微生物原生質(zhì)體融合原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合真菌的原生質(zhì)體融合（一）微生物原生質(zhì)體融合的優(yōu)勢（1）大幅度提高親本之間的重組頻率細(xì)胞壁是微生物細(xì)胞之間物質(zhì)、能量和信息交流的主要屏障，同時(shí)也阻礙了細(xì)胞遺傳物質(zhì)的交換和重組，而原生質(zhì)體剝離了細(xì)胞壁，去除了細(xì)胞間物質(zhì)交換的主要障礙。融合過程中促融合劑的誘導(dǎo)作用，重組頻率顯著提高。（一）微生物原生質(zhì)體融合的優(yōu)勢（2）擴(kuò)大重組的親本范圍常規(guī)雜交的親本間必須有感受態(tài)，而有的菌株由于其表面結(jié)構(gòu)緣故而無法用常規(guī)雜交方法實(shí)現(xiàn)重組。原生質(zhì)體由于完全或部分失去了細(xì)胞壁，因此可以實(shí)現(xiàn)種間、屬間甚至門間的遠(yuǎn)緣雜交。（一）微生物原生質(zhì)體融合的優(yōu)勢（3）遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親本優(yōu)良性狀的機(jī)會(huì)更大原生質(zhì)體融合時(shí)親本整套染色體參與交換。原生質(zhì)體融合時(shí)還同時(shí)傳遞了細(xì)胞質(zhì)。除進(jìn)行雙親融合外，還能進(jìn)行多親融合。（二）微生物原生質(zhì)體融合的基本步驟（1）親本及遺傳標(biāo)記的選擇原生質(zhì)體親本的選擇應(yīng)采用具有較大遺傳差異的近親菌株，重組后的新個(gè)體具有更大的雜種優(yōu)勢。遺傳標(biāo)記：應(yīng)帶有遺傳標(biāo)記，便于重組體的檢出。應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇遺傳標(biāo)記。營養(yǎng)缺陷和抗性標(biāo)記用于遺傳分析；熱致死（50℃2h或60℃5min）用于大規(guī)模生產(chǎn)育種；孢子顏色是新技術(shù)，熒光染色；菌落形態(tài)。（2）原生質(zhì)體制備酶法分離原生質(zhì)體的影響因素培養(yǎng)基組成菌體培養(yǎng)方式菌體菌齡穩(wěn)定劑酶解前的預(yù)處理酶系和酶的濃度酶的作用溫度和pH菌體密度酶解方式（3）原生質(zhì)體再生

定義:

原生質(zhì)體在穩(wěn)定的再生培養(yǎng)基上，重新形成細(xì)胞壁，恢復(fù)至完整細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步生長、分裂和增殖，這一過程就是原生質(zhì)體再生。（3）原生質(zhì)體再生

定義:

原生質(zhì)體在穩(wěn)定的再生培養(yǎng)基上，重新形成細(xì)胞壁，恢復(fù)至完整細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步生長、分裂和增殖，這一過程就是原生質(zhì)體再生。影響再生的因素①菌體生理狀態(tài)年輕細(xì)胞比年老的細(xì)胞容易再生，菌絲頂端比老菌絲容易再生。②穩(wěn)定劑高滲溶液③酶濃度和