人臍帶血可成為間充質(zhì)干細(xì)胞新來源的分子機(jī)制研究

人臍帶血可成為間充質(zhì)干細(xì)胞新來源的分子機(jī)制研究

中間細(xì)胞（msc）是一個(gè)非全日制干旱患者，具有多向分化潛力，可以通過外部分裂生長和擴(kuò)大，遺傳背景穩(wěn)定。它是組織工程中種子的重要細(xì)胞之一。MSCs的來源廣泛,成人骨髓、成人外周血、人臍帶血(humanumbilicalcordblood,HUCD)、胎盤等均發(fā)現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞存在。MSCs易于外源基因的表達(dá),而且MSCs所攜帶的外源基因表達(dá)具有明顯的組織特異性,因此MSCs有可能成為一種新型的基因治療的靶細(xì)胞。而臍帶血來源相對于骨髓來源的MSCs更為原始、免疫原性低,功能更為強(qiáng)大,采集更為簡單且無損傷,兩者又有相同的生物學(xué)特性和免疫表型,可幫助鑒別篩選HUCDMSCs,并使之可能成為一種新的MSCs來源。已有研究報(bào)道MSCs可以追蹤神經(jīng)源性腫瘤細(xì)胞,這種對腫瘤的趨化特性可以治療腫瘤的衛(wèi)星病灶。因此MSCs有望成為腫瘤基因治療的理想轉(zhuǎn)基因載體。本實(shí)驗(yàn)旨在探討HUCD可否作為MSCs的又一重要新來源,MSCs對卵巢癌細(xì)胞是否存在趨化作用,為卵巢癌基因治療的靶向載體的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)和方法1.材料表面(1)然產(chǎn)孕產(chǎn)婦及孕產(chǎn)婦模型臍帶血:選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科足月健康的自然產(chǎn)孕婦,征求其同意,無菌操作獲得臍帶血50ml,20U/ml肝素抗凝,4℃冰箱保存,12h內(nèi)分離;細(xì)胞株:人卵巢上皮癌HO-8910細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室提供。(2)熒光標(biāo)記鼠抗體paisIMDM(Gibco,Paisley,USA);胎牛血清(Gibco,Paisley,USA);淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll,天津TBD公司);熒光標(biāo)記鼠抗人抗體CD13-FTTC、CD14-FTTC、CD29-FTTC、CD34-FTTC、CD44-FTTC、CD45-FTTC、CD105-FTTC(BD,USA);N2培養(yǎng)基(Gibco,Paisley,USA);胰酶消化液(碧云天公司);Millicellinsert(Millipore,Billerica,MA,USA)其他試劑儀器由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。2.方法(1)傳統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)完全培養(yǎng)液:IMDM+10%或者20%胎牛血清+1%青鏈霉素,pH值7.2±偏酸性;脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng):1%N2培養(yǎng)基+IMDM;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng):傳代培養(yǎng)液+10-8mol/l地塞米松+10mmolβ-甘油磷酸鈉+50mg/l維生素C,pH值7.2;油紅O儲存液:油紅干粉0.5g+100ml異丙醇,60℃水浴,玻璃棒攪拌至完全溶解,密封4℃冰箱保存。(2)細(xì)胞培養(yǎng)和分離臍帶血與PBS緩沖液1∶1混勻稀釋后,以2∶1體積將稀釋液緩慢疊加于人淋巴細(xì)胞分離液上,2000r/min離心20min,收集乳白色云霧狀單核細(xì)胞層。PBS稀釋洗滌收集液2次,800r/min離心5min,收集細(xì)胞沉淀,加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)液,制成細(xì)胞懸液,以5×106/ml密度接種于25cm3塑料培養(yǎng)瓶中(Corning,USA)。置于37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,2-3天半量換液,5-7天全量換液,去除未貼壁細(xì)胞,以后每3天換液,去除雜細(xì)胞。4-5周細(xì)胞融合達(dá)80%-90%,適時(shí)傳代。用胰酶消化液1∶3傳代,利用破骨樣細(xì)胞與MSCs對其敏感性不同,可粗略分離。HO-8910復(fù)蘇后,加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液接種于25cm3塑料培養(yǎng)瓶中置于37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,1-2天半量換液,3-4天全量換液,去除未貼壁細(xì)胞,以后每2-3天換液。細(xì)胞融合達(dá)80%-90%時(shí)1∶3傳代。(3)赫sdmsc和ho-8910的生物學(xué)形態(tài)于倒置顯微鏡下觀察,拍照。(4)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)脂肪細(xì)胞誘導(dǎo):取P3代HUCDMSCs,以105/ml密度接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后加入脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng),誘導(dǎo)2-3周,每3-4天換液1次,倒置顯微鏡下觀察。適時(shí)油紅O染色法染色,顯微鏡下觀察脂肪滴。成骨細(xì)胞誘導(dǎo):取P3代HUCDMSCs,以5×103/cm2密度接種于6孔板和直徑60mm培養(yǎng)皿中,分別加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng),每周換液2次,誘導(dǎo)1-3周。誘導(dǎo)后利用鈣沉積法觀察。以上誘導(dǎo)均設(shè)置未誘導(dǎo)組做空白對照。(5)熒光標(biāo)記大鼠抗人抗體檢測分別取P1、P3、P10代HUCDMSCs制成106/ml的細(xì)胞懸液。每管加入500μl細(xì)胞懸液,再加入熒光標(biāo)記鼠抗人抗體CD13-FTTC、CD14-FTTC、CD29-FTTC、CD34-FTTC、CD44-FTTC、CD45-FTTC、CD105-FTTC,同時(shí)設(shè)計(jì)1管空白對照組,于4℃孵育30min。PBS洗去未結(jié)合抗體,流式細(xì)胞儀分析。(6)mscs的制備HO-8910、MSCs和空白培養(yǎng)液分別置于Millicell下層,MSCs置于上層,共用培養(yǎng)液,37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48h。在MSCs一側(cè)的聚碳酸酯薄膜上HE染色,光鏡下任選5處計(jì)細(xì)胞數(shù),試驗(yàn)重復(fù)3次。(7)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.hucdmscs的分離和鑒定HUCDMSCs于3-7天貼壁,10天左右出現(xiàn)細(xì)小棒狀初始細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞核清晰,邊界清楚,細(xì)胞逐漸變長,有些帶有多個(gè)分支,胞質(zhì)逐漸飽滿。經(jīng)換液和偏酸性培養(yǎng)基的篩選,及傳代篩選,HUCDMSCs于P3代鏡下未再出現(xiàn)非MSCs形態(tài)細(xì)胞,貼壁細(xì)胞均呈長梭形按一定極性的旋渦狀生長(圖1)。HO-8910細(xì)胞復(fù)蘇成功,生長狀態(tài)良好(圖2)。2.成骨細(xì)胞誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后大量細(xì)胞內(nèi)可見融合成團(tuán)的脂肪滴,對照組未出現(xiàn)脂肪滴,油紅O染色陰性。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)3周時(shí)可見黑色礦化結(jié)節(jié)沉積,陰性對照無變化。成功的在體外將HUCDMSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞(圖3、圖4)。3.dmscs細(xì)胞表達(dá)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明,CD29、CD44、CD105在HUCDMSCs細(xì)胞為陽性表達(dá),而CD13、CD14、CD34、CD45為陰性(圖5)。免疫表型特點(diǎn)不隨細(xì)胞傳代增加而改變,結(jié)果證明HUCDMSCs與骨髓來源的MSCs有相同的細(xì)胞表面標(biāo)記。4.聚碳酸酯薄膜收集各組聚碳酸酯薄膜,HE染色,鏡下計(jì)數(shù)。MSCs組,MSCs遷移到聚碳酸酯薄膜上的數(shù)量是113.33±8.96?？瞻着囵B(yǎng)液組數(shù)量是98.67±10.34。而HO-8910是519.67±19.96(圖6)。數(shù)據(jù)顯示人MSCs對HO-8910有趨化作用(P<0.05)。細(xì)胞生物學(xué)特性MSCs是近年來干細(xì)胞生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的重要細(xì)胞之一,它存在于多種組織中。2000年,Erices等首次報(bào)道了MSCs可以從HUCD中分離培養(yǎng)出來,但是在試驗(yàn)中的29例樣品中,只有7例表現(xiàn)為間充質(zhì)樣細(xì)胞,其免疫表型和功能特點(diǎn)與骨髓來源的MSCs極為相似,其余均為破骨樣細(xì)胞,因此存在諸多爭議。隨著HUCDMSCs的研究越來越多,科技的進(jìn)步和方法的優(yōu)化,大家的結(jié)論也趨于一致,認(rèn)為HUCD中存在MSCs,但是比例遠(yuǎn)不及骨髓中的含量。MSCs是混合細(xì)胞群,目前還沒有找到它特異的抗原標(biāo)記,鑒定它主要根據(jù)其形態(tài)、功能等。1991年,Canplan把從骨髓中提出的可以在體外高度擴(kuò)增,并可多向分化的細(xì)胞群命名為MSCs,這組細(xì)胞形態(tài)呈長梭形成纖維樣的細(xì)胞,按一定極性漩渦狀生長。1997年P(guān)ittenger等發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs可以在體外不同分化條件下誘導(dǎo)形成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。這種多能分化功能,充分證明了骨髓MSCs是一種多能干細(xì)胞。許多研究表明,MSCs的免疫標(biāo)記特點(diǎn)是,SH2(﹢)、SH3(﹢)、CD29(﹢)、CD44(﹢)、CD71(﹢)、CD90(﹢)、CD105(﹢)、CD106(﹢)、CD120a(﹢)、CD124(﹢)、CD166(﹢);而CD34、CD45、CD177等造血細(xì)胞表面標(biāo)記為陰性,HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40等與移植免疫排斥相關(guān)的表面標(biāo)志均為陰性。已有研究報(bào)道神經(jīng)干細(xì)胞可以追蹤擴(kuò)散的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,這種對腫瘤的趨化特性可以治療腫瘤的衛(wèi)星病灶。相關(guān)研究表明,干細(xì)胞對腫瘤具有趨化作用。因此間充質(zhì)干細(xì)胞有可能成為腫瘤基因治療的理想轉(zhuǎn)基因載體。以MSCs作為基因治療的靶向載體進(jìn)行的研究,國內(nèi)外偶見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)成功從HUCD中分離出MSCs,無論在生物形態(tài)、體外誘導(dǎo)分化能力還是免疫表型上都與骨