理學(xué)蛋白質(zhì)和氨

9.1概述（1）食品中的蛋白質(zhì)含量及測(cè)定意義（2）蛋白質(zhì)系數(shù)（3）蛋白質(zhì)測(cè)定方法思考1、蛋白質(zhì)系數(shù)是如何計(jì)算出來的？2、蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有哪些？國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是哪一種方法？3、為什么說用凱氏定氮法測(cè)出的是粗蛋白的含量？食品中的蛋白質(zhì)含量牛肉豬肉兔肉雞肉

209.52120大豆米面粉菠菜蘋果

408.5102.4

0.4

測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義。

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、S、Cu、Fe、I等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。蛋白質(zhì)的測(cè)定意義

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

蛋白質(zhì)系數(shù)不同食物原料的蛋白質(zhì)換算系數(shù)小麥、大麥、黑麥、燕麥、小米5.83大米5.95玉米、高梁6.24小麥粉及制品5.70向日葵籽、芝麻、南瓜籽5.40可可豆、榛子、椰子、核桃5.30花生5.46大豆及其制品5.71蛋、肉及其制品6.25動(dòng)物膠5.559.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法

是通過測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)用凱氏定氮法通過測(cè)總氮量來確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測(cè)定結(jié)果稱為。凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍被作為應(yīng)用范圍可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定。粗蛋白標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法凱氏定氮法

常量法

微量法

改良凱氏定氮法微量凱氏定氮法

樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。目前通用以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法。在凱氏法改良中主要的問題氮化合物中氮的完全氨化、縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作及所用的催化劑常量改良凱氏定氮法

用二氧化鈦?zhàn)龃呋瘎﹦P氏定氮法學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)

半微量凱氏定氮法的原理測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范。9.2.1凱氏定氮法(1)

原理樣品消化（NH4）2SO4濃H2SO4CuSO4、KSO4NaOHNH3H3BO3（NH4）2B4O7（NH4）Cl微量凱氏定氮裝置

①消化

消化反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4

＝

(NH4)2SO4

＋6CO2

＋12SO2

＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。

濃硫酸又具有氧化性,將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO4

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：

加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下：②蒸餾

③吸收與滴定2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3：樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。

(2)測(cè)定方法①

樣品消化觀察與思考：1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？2、消化過程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么？3、瓶頸有什么毒煙產(chǎn)生？4、如何判斷消化的終點(diǎn)？改進(jìn)后的水化裝置②

蒸餾

按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。

在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。思考：1、為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入指示劑甲基橙和硫酸？加入數(shù)粒玻璃珠的作用是什么？

取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。③滴定

式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V2—蒸餾時(shí)吸取樣品稀釋液體積，mL；

C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；

0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；

F—蛋白質(zhì)系數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g。(5)結(jié)果計(jì)算（3）樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4

：提高溶液的沸點(diǎn)CuSO4：

C＋2CuSO4→Cu2SO4

＋SO2↑CO2↑Cu2SO4

＋2H2SO4→2CuSO4

＋2H2O＋SO2↑氧化汞和汞良好的催化劑，但劇毒；硒粉

硫酸鉀的作用

加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

一般純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大

，故沸點(diǎn)升高。硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O硫酸銅的作用①催化劑2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②指示消化終點(diǎn)③下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。（1）

所用試劑應(yīng)用無氨蒸餾水配制。加指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性。（2）

若樣品含脂肪或糖較多時(shí)，應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫應(yīng)加入少量辛醇、液體石蠟、或硅油消泡劑，防止溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（3）

若樣品消化液不易澄清透明，可加入300g/L

2~3ml

過氧化氫后再加熱。(4)注意事項(xiàng)（5）硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時(shí)樣品液堿化的指示劑，若所加堿量不足，分解液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，需再增加氫氧化鈉用量。（6）若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。（7）消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可，消化時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。一般消化至透明后繼續(xù)30分鐘即可.（8）蒸餾過程應(yīng)注意接頭處無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（9）硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（10）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。（11）蒸餾過程中，水蒸汽不得中止。（12）消化液不得蒸干。9.2.2氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算、說明電位滴定法：原理、試劑、儀器、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算

氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互租用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。反應(yīng)式（有三種不同的推論）如下：RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO1.雙指示劑甲醛滴定法(1)原理

移取含氨基酸約20～30mg的樣品溶液2份，分別置于250ml錐形瓶中，各加50ml蒸餾水，其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。(4)操作方法式中

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol

(5)結(jié)果計(jì)算

氨基酸態(tài)氮

（%）(1)原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。(2)儀器酸度計(jì)（附磁力攪攔器）；2.電位滴定法式中：C-----氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L：

G------鄰苯二甲酸氫鉀的重量，g；

V------氫氧化鈉溶液用量，mLV0----空白試驗(yàn)氫氧化鈉溶液用量，mL；

204.2—鄰苯二甲酸氫鉀的分子量。按下式計(jì)算NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量濃度C=G(V-V0)ⅹ10-3ⅹ204.2(4)試驗(yàn)步驟①吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL燒杯中，加60mL水，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2（記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，可計(jì)算總酸含量）。②加入0.1mL甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)。③同時(shí)取80mL水，先用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，做試劑空白試驗(yàn)。（5）結(jié)果計(jì)算①數(shù)據(jù)記錄加甲醛前耗NaOH量/mL加甲醛后耗NaOH量/mLNaOH標(biāo)準(zhǔn)液濃度/mol.L-1樣品滴定123平均空白滴定123平均式中ρ--------------氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，g/100mL;c--------------氫氧化鈉濃度，mol/L；

V1------------加入甲醛后耗NaOH的量，ml；

V2------------空白試驗(yàn)加甲醛后耗NaOH量，ml；

V3------------測(cè)定用樣品稀釋液的量，ml；

M氮----------氮的摩爾質(zhì)量，14.01g/mol；

5-------------樣品量，ml.②計(jì)算氮9.2.3揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮是食品尤其是動(dòng)物性食品中的蛋白質(zhì)在酶及細(xì)菌作用下分解產(chǎn)生的氨及胺類物質(zhì)。對(duì)食品（肉）的新鮮度具有指示性作用。鮮（凍）肉揮發(fā)性鹽基氮≤20mg/100g

海魚30

淡水魚20

咸雞蛋10意義測(cè)定原理?yè)]發(fā)性鹽基氮堿性氧化鎂Δ氨硼