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青海弧菌q65在污水生物急性毒性檢測(cè)中的應(yīng)用

目前，主要的廢水控制指標(biāo)包括總氮（tn）、總磷（tp）、生化需氧量（bod）、化學(xué)需氧量（cod）、固體懸浮固體（ss）、總有機(jī)碳（toc）等。然而，這些物理和化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)不能很好地反映排放的廢水水質(zhì)。雖然廢水中含有的重金屬和永久性有機(jī)污染物（pops）的含量較低，但它們的毒性較高，通常表現(xiàn)為導(dǎo)致癌、畸形和突變。目前，這種微有毒物質(zhì)的檢測(cè)方法包括原子吸收光譜、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)合、高效液相層析成像等。然而，這些設(shè)備價(jià)格昂貴，技術(shù)要求很重，實(shí)驗(yàn)周期長。在一般的實(shí)驗(yàn)條件下，很難在室外進(jìn)行檢測(cè)這些物質(zhì)。水生生物對(duì)生態(tài)毒性的檢測(cè)方法有:魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)、水蚤類毒性實(shí)驗(yàn)、藻類毒性實(shí)驗(yàn)、微生物毒性實(shí)驗(yàn).其中,微生物毒性實(shí)驗(yàn)多采用發(fā)光細(xì)菌法.由于它的檢測(cè)時(shí)間短、敏感性好、重現(xiàn)性好、費(fèi)用低,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)場地要求較低,因而得到廣泛的應(yīng)用.發(fā)光細(xì)菌法與藻類、水蚤、魚類等生物毒性監(jiān)測(cè)具有很好的相關(guān)性.青?；【鶴67是我國發(fā)現(xiàn)的一種廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染監(jiān)測(cè)的淡水發(fā)光細(xì)菌.這種細(xì)菌已經(jīng)用來檢測(cè)環(huán)境中的重金屬、抗生素、除草劑、殺蟲劑和受污染的河流等水樣[8~11].淡水發(fā)光細(xì)菌Q67與海洋發(fā)光細(xì)菌在生物毒性檢測(cè)方面具有同樣的有效性和可靠性.但是海洋發(fā)光細(xì)菌需要將測(cè)試水樣調(diào)節(jié)成含NaCl2%~3%的水樣.這可能改變了淡水樣品中毒性物質(zhì)的特性.因此海洋發(fā)光細(xì)菌對(duì)淡水樣品的檢測(cè)存在一定的局限性,而且大部分環(huán)境樣品對(duì)青?；【鶴67比對(duì)T3發(fā)光菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性.與檢測(cè)單種或2種化學(xué)品的生物毒性相比,天然水樣具有成分復(fù)雜、干擾因素多等特點(diǎn).這導(dǎo)致了水樣生物毒性檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確性.有的研究者指出,急性毒性實(shí)驗(yàn)可能低估了一些物質(zhì)的毒性,特別是具有特殊作用方式的物質(zhì).對(duì)天然水樣直接進(jìn)行發(fā)光菌和藻類等毒性實(shí)驗(yàn)會(huì)受到共存物質(zhì)刺激發(fā)光或刺激生長的影響.例如對(duì)NH4+-N或PO43--P含量高的水體,由于其刺激發(fā)光或作為營養(yǎng)物質(zhì)的作用掩蓋了毒性物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的作用,可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)論.發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試過程中的刺激發(fā)光現(xiàn)象主要是因?yàn)楦蓴_因素的影響.所以對(duì)水樣進(jìn)行必要的前處理對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義.本研究的目的是采用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)污水廠各處理單元進(jìn)出水的生物急性毒性,并對(duì)污水生物毒性檢測(cè)的影響因素進(jìn)行了初步分析.這對(duì)污水處理與回用過程中,水體生物毒性的準(zhǔn)確判斷具有重要的實(shí)際意義.1材料和方法1.1生物毒性測(cè)試污水來源于以O(shè)rbal氧化溝為主要處理工藝的某污水廠各處理單元的進(jìn)出水.選取的5個(gè)取樣點(diǎn)分別為細(xì)格柵出水、氧化溝進(jìn)水、氧化溝出水、終沉池出水、UV消毒出水.污水處理工藝流程及取樣點(diǎn)如圖1所示.水樣取回后,采取如下處理方法:(1)用濾紙過濾后立即進(jìn)行生物毒性測(cè)試;(2)水樣經(jīng)濾紙過濾后,分別放置1~5d,然后分別進(jìn)行生物毒性測(cè)試;(3)水樣取回后用0.45μm微濾膜過濾后放置1d,然后進(jìn)行生物毒性測(cè)試;(4)高壓滅菌后放置1d,然后進(jìn)行生物毒性測(cè)試;(5)采集的水樣經(jīng)過0.45μm的微濾膜過濾后,用C18固相萃取小柱(500mg3mLPK54)富集有機(jī)物,具體操作如下:依次將7mL的二氯甲烷、甲醇、純水通過固相萃取小柱進(jìn)行潤濕活化,中間不允許填料抽干.水樣經(jīng)0.45μm濾膜過濾后上樣,使水樣連續(xù)通過SPE柱,調(diào)節(jié)真空泵的真空度,使液滴1s左右滴一滴.水樣全部過濾完后再用5mL純水洗滌,繼續(xù)真空抽氣干燥15min.將SPE柱放在離心機(jī)中離心15min,轉(zhuǎn)速4000r/min.最后用二氯甲烷洗脫柱子,收集洗脫液,用高純氮?dú)獯蹈?用0.5%的二甲基亞砜溶解后用于生物毒性測(cè)試.實(shí)驗(yàn)中使用的0.45μm濾膜需在超純水中煮沸然后使用,并在過濾時(shí)棄去前半部分濾樣.1.2kcl/aclo青?；【鶴67(購自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)的培養(yǎng)采用可以得到較高菌生物量和對(duì)菌內(nèi)熒光酶含量有利的培養(yǎng)基.培養(yǎng)基成分為:胰胨0.5%,酵母膏0.5%;甘油0.3%;MgCl20.32%;KBr0.02%;CaSO40.01%;NaCl0.4%;KCl0.4%;pH8.5±0.5,培養(yǎng)溫度為22℃±1℃.培養(yǎng)時(shí)間10~12h.細(xì)菌生長曲線如圖2所示.將4℃保存的青海弧菌Q67斜面菌種轉(zhuǎn)接到50mL液體培養(yǎng)基中,22℃培養(yǎng)10~12h達(dá)到對(duì)數(shù)中后期.起始菌液濃度在200萬~600萬RLU之間.在1.5mL樣品管中加入500μL樣品溶液(每組3個(gè)平行,每一組樣品前設(shè)一個(gè)空白),50μL菌懸液,每次加菌液時(shí)間間隔20s,15min后(精確到秒)將樣品管放入ModulusTM單管型多功能檢測(cè)儀(美國TurnerBiosystems公司)上進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè).計(jì)算出所有空白樣的平均值(I0)和每個(gè)樣品3次測(cè)量的平均值(I),按公式(1)計(jì)算出每個(gè)樣品對(duì)發(fā)光菌的相對(duì)抑制率(E).當(dāng)樣品表現(xiàn)為刺激發(fā)光作用時(shí),相對(duì)抑制率以負(fù)值表示.1.3檢測(cè)傳統(tǒng)指標(biāo)的方法COD、TN、TP的測(cè)定采用《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)中的標(biāo)準(zhǔn)方法.TOC的測(cè)定使用TOC測(cè)定儀.2結(jié)果與分析2.1微濾和蒸發(fā)時(shí)間tn的變化各種預(yù)處理方法會(huì)在一定程度上改變樣品的組成[19~21].水樣的預(yù)處理對(duì)水樣的影響是不可避免的.因此,通過檢測(cè)各種水樣經(jīng)預(yù)處理后的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)的變化來監(jiān)測(cè)預(yù)處理對(duì)水樣產(chǎn)生的影響.各取樣點(diǎn)污水在經(jīng)過濾紙過濾、0.45μm微濾膜過濾、滅菌處理以及濾紙過濾后放置4種處理方法后,水樣水質(zhì)變化情況如表1所示.由表1可見,與原污水相比,水樣經(jīng)過0.45μm微濾膜過濾后,5個(gè)水樣的各個(gè)指標(biāo)都略有降低;水樣經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后,5個(gè)水樣的COD和TOC都略有升高.這可能是因?yàn)楦邷厥顾胁糠址侨芙鈶B(tài)的有機(jī)物溶解導(dǎo)致水中的COD和TOC升高;原污水放置1d后細(xì)格柵出水和氧化溝進(jìn)水的COD和TN有明顯的降低,COD分別從338.00mg/L、323.28mg/L降低到217.82mg/L、215.16mg/L,TN分別從39.87mg/L、31.15mg/L降低到24.95mg/L、18.83mg/L;氧化溝出水、終沉池出水和UV消毒出水的TP有明顯的降低,分別從0.20mg/L、0.20mg/L、0.41mg/L降低到0.11mg/L、0.10mg/L、0.10mg/L.這些變化可能是因?yàn)樗械募?xì)菌新陳代謝消耗了水中的部分有機(jī)物.2.2廢水的生物毒性測(cè)試水樣取回后倒入錐形瓶內(nèi),常溫保存.每次從錐形瓶內(nèi)取得水樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前都先用定性濾紙過濾.進(jìn)行生物毒性測(cè)試前每100mL水樣加入10g乳糖.空白對(duì)照采用10%的乳糖溶液.第1d的生物毒性測(cè)試在取回水樣的4h內(nèi)進(jìn)行.5個(gè)取樣點(diǎn)5d內(nèi)的毒性測(cè)試結(jié)果如圖3所示.從圖3中可以看出,除了細(xì)格柵出水和氧化溝進(jìn)水在取回后立即進(jìn)行毒性測(cè)試測(cè)得相對(duì)抑制率分別為10.14%和7.65%,其它各個(gè)工藝的水樣在第1d都沒有顯現(xiàn)出毒性.細(xì)格柵出水和氧化溝進(jìn)水水樣放置到第2d毒性大大增強(qiáng),相對(duì)抑制率分別達(dá)到50.63%和39.52%,而且以后的4d都顯現(xiàn)出毒性.這可能是由于污水中的細(xì)菌消耗掉水中的可以作為營養(yǎng)物質(zhì)的有機(jī)物.在去除了營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的刺激作用的情況下,毒性物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制作用更為明顯.而且細(xì)格柵出水和氧化溝進(jìn)水的營養(yǎng)物質(zhì)也相對(duì)較多,COD較高,放置過程中COD和TN有明顯的降低.氧化溝出水水樣在第5d才顯現(xiàn)出毒性.終沉池和UV消毒出水始終沒有顯現(xiàn)出毒性.氧化溝出水、終沉池出水、UV消毒出水3個(gè)取樣點(diǎn)在放置過程中TP有較明顯的降低,但生物毒性沒有發(fā)生很大變化.2.3水樣生物毒性測(cè)試水樣取回后倒入錐形瓶內(nèi),常溫保存.每次從錐形瓶內(nèi)取得水樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前都用濾紙或0.45μm膜過濾.過濾時(shí),棄去前50mL水樣.毒性實(shí)驗(yàn)以超純水作為空白對(duì)照.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)水樣在取回的第1d毒性測(cè)試會(huì)刺激發(fā)光,所以采用存放1d的水樣進(jìn)行毒性測(cè)試.由圖4可知,用濾紙過濾5個(gè)水樣后進(jìn)行毒性測(cè)試都是刺激細(xì)菌發(fā)光,但是用0.45μm膜過濾后,去除了水中非溶解態(tài)物質(zhì)對(duì)生物毒性檢測(cè)的干擾.細(xì)格柵出水、氧化溝進(jìn)水、氧化溝出水出現(xiàn)抑制發(fā)光現(xiàn)象.因?yàn)榘l(fā)光細(xì)菌可能吸附在顆粒物質(zhì)上,而且引起濁度的物質(zhì)對(duì)光有散射和折射的作用,干擾生物毒性的檢測(cè).水樣經(jīng)過0.45μm膜過濾后,生物毒性檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確,而且對(duì)水樣組成改變較小.經(jīng)過0.45μm膜過濾后各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)略有降低,但變化不大.2.4高壓蒸汽滅菌后水樣的生物急性毒性變化水樣取回后倒入錐形瓶內(nèi),高壓蒸汽滅菌器中滅菌,放入超凈室內(nèi)保存.每次實(shí)驗(yàn)前都先用0.45μm膜過濾,并棄去前50mL水樣.毒性實(shí)驗(yàn)以超純水作為空白對(duì)照.第1d的毒性測(cè)試在取回水樣后4h內(nèi)進(jìn)行.5個(gè)取樣點(diǎn)2d的毒性測(cè)試結(jié)果如圖5所示.細(xì)格柵出水經(jīng)過滅菌在2d內(nèi)都顯現(xiàn)出毒性.除了細(xì)格柵出水,各個(gè)工藝段在整個(gè)測(cè)試過程中都沒有顯現(xiàn)出毒性.在放置1d后,5個(gè)水樣沒有出現(xiàn)由刺激發(fā)光變?yōu)橐种瓢l(fā)光的現(xiàn)象.這說明高壓蒸汽滅菌后的水樣不會(huì)因?yàn)榇娣哦霈F(xiàn)逆反的現(xiàn)象.滅菌后水樣的生物急性毒性趨于穩(wěn)定.2.5污水廠各工藝進(jìn)出水的生物毒性由于污水中含有的NH4+-N或PO43--P等物質(zhì)影響生物毒性的測(cè)定,采用各種萃取方法去除干擾物質(zhì)可使生物毒性的檢測(cè)更為準(zhǔn)確,并且更具有污染物的生物毒性的針對(duì)性.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,水樣被濃縮成7個(gè)濃度梯度,求出相對(duì)發(fā)光率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的污水濃度,即半數(shù)發(fā)光抑制率濃度EC50.污水廠各工藝進(jìn)出水的生物毒性結(jié)果如表2所示.可以看出,細(xì)格柵出水和氧化溝進(jìn)水的生物毒性差別不大.污水經(jīng)過氧化溝處理后,氧化溝出水的毒性變小,但是終沉池和UV消毒出水的毒性與氧化溝出水相比又略有升高.由于入廠水中工業(yè)污水約占50%,存在著較多的有毒有機(jī)污染物.經(jīng)氧化溝工藝處理后,有毒物質(zhì)得到了一定程度的去除,污水毒性減弱,但仍有一定程度的存留.這與前人的研究結(jié)果相類似.這說明以活性污泥法為主體的處理工藝對(duì)生物毒性物質(zhì)的去除十分有限.經(jīng)過固相萃取后,污水即使在低濃縮倍數(shù)下也沒有出現(xiàn)刺激發(fā)光的現(xiàn)象.固相萃取可以很好地去除干擾生物毒性測(cè)定的物質(zhì).3通過生物毒性實(shí)驗(yàn)來保證污水的生物毒性(1)污水經(jīng)過不同的預(yù)處理后各項(xiàng)水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)有所變化.與原污水相比經(jīng)過0.45μm微濾膜過濾后,各項(xiàng)指標(biāo)都略有降低;水樣經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后,5個(gè)水樣的COD和TOC都略有升高;放置1d后,細(xì)格柵出水和氧化溝進(jìn)水的COD和TN有明顯的降低,氧化溝出水、終沉池出水和UV消毒出水的TP有明顯的降低.(2)原污水直接進(jìn)行生物毒性實(shí)驗(yàn),所有水樣都促進(jìn)細(xì)菌發(fā)光