真菌致病基因的標記

真菌致病基因的標記

真菌感染植物是一個復(fù)雜的過程。通過分子遺傳突變技術(shù)從真菌中分離出許多疾病基因。其中，限制酶誘導(dǎo)移植技術(shù)是最常用的方法之一，不僅可以了解真菌的過程，而且可以為控制分子水平的疾病提供有用的線索。不同的遺傳因素導(dǎo)致不同的侵蝕過程。一些真菌依靠釋放表皮和/或控制寄生蟲。有些形成了一種特殊的結(jié)構(gòu)，例如通過表皮的移植。一些人還依靠外部或內(nèi)部的接觸和化學(xué)習(xí)劑。入侵后的真菌在不同的營養(yǎng)方式下相互參與，整個入侵過程結(jié)束。據(jù)報道，在真菌中發(fā)現(xiàn)了79個疾病基因，這些基因可以根據(jù)不同的功能分為幾個部分。1分子自身結(jié)構(gòu)基因附著胞是真菌的重要侵染結(jié)構(gòu).環(huán)境和遺傳因素決定附著胞的產(chǎn)生.附著胞內(nèi)膨壓很高,受膨壓作用,附著胞表面伸出侵染釘穿透寄主表皮.致病型灰梨孢菌(Magnaporthegrisea)中,附著胞含濃度很高的甘油,可達到摩爾級,同時壁上的黑色素(DHN)阻止胞內(nèi)物質(zhì)外流維持附著胞的高膨壓.反之,缺乏黑色素的附著胞不能形成膨壓,也就不具備侵染能力.葫蘆刺盤孢菌(Colletotrichumlagenarium)、豆刺盤孢菌(Clindemuthianum)和禾生刺盤孢菌(Cgraminicola)侵入寄主也需要黑色素.已發(fā)現(xiàn)灰梨孢菌和葫蘆刺盤孢菌中至少3個結(jié)構(gòu)基因與黑色素合成有關(guān).另外,一些基因控制著附著胞的發(fā)育.譬如在灰梨孢菌中,mpg1基因所編碼的一種疏水蛋白是形成附著胞所必須的,抑制mpg1基因表達將導(dǎo)致灰梨孢菌致病性降低,產(chǎn)孢能力(conidiation)也下降100倍左右.通過互補分析,分離到3個基因NPR1,NPR2,NPR3,它們編碼的產(chǎn)物調(diào)節(jié)著mpg1的轉(zhuǎn)錄.Lau和Hamer發(fā)現(xiàn)NPR1和NPR2基因與梨孢菌的氮代謝有關(guān).從灰梨孢菌分生孢子中克隆出一個ACR1基因,該基因序列與轉(zhuǎn)錄因子有部分同源,ACR1基因突變后導(dǎo)致無法產(chǎn)生正常的分生孢子并影響附著胞形成.同樣,灰梨孢菌編碼膜蛋白的基因pth11突變后,梨孢菌無法正確識別寄主葉面,影響了附著胞產(chǎn)生.通過轉(zhuǎn)座子標記技術(shù),Villalba等從灰梨孢菌中克隆出ORP1基因,此基因與附著胞形成無關(guān),但是突變后灰孢菌致病性也降低,目前還不清楚該基因的作用.最近,Balhadere等通過限制酶介導(dǎo)的插入技術(shù)(REMI)從灰梨孢菌中發(fā)現(xiàn)了4個基因與分生孢子和附著胞形成有關(guān).但是這些基因的結(jié)構(gòu)特征還不清楚.2果膠酸水解酶基因水解酶是真菌致病的重要酶,大部分是多基因家族或沒有同源關(guān)系的基因編碼的多肽.由于是多基因編碼,一個基因突變后可能并不影響病原菌的致病力.一方面,活化的水解酶常伴隨產(chǎn)生大量的寡聚糖,這些寡聚糖可以激發(fā)植物的防御反應(yīng);另一方面,被水解下來的植物胞壁蛋白也可以激發(fā)自身的防御反應(yīng),所以水解酶的作用很復(fù)雜.Enkerli等發(fā)現(xiàn)裸異木霉(Trichodermareesei)編碼木聚酶Ⅱ的基因突變后,木聚酶Ⅱ活性下降了1000倍,但是木霉仍能感染番茄和煙草.角質(zhì)酶也屬于多基因家族,在需要直接穿透寄主表皮的真菌中是重要的致病因子.Rogers等和Stahl等分別對腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)研究發(fā)現(xiàn),當角質(zhì)酶合成受抑制后,腐皮鐮孢菌失去了致病能力.果膠酸水解酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲基酯酶是真菌致病的重要酶.植物胞壁含有大量的果膠和中間層,真菌成功侵入寄主需要克服這些障礙.譬如盤長孢刺盤孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)中編碼果膠酸水解酶的pelB基因突變后,對鱷梨的致病性就會降低.但是也有例外.Bowen等研究發(fā)現(xiàn)圍小叢殼菌(Glomerellacingulata)果膠水解酶基因plnA突變后不影響致病能力.Rogers等研究腐皮鐮孢菌發(fā)現(xiàn),編碼果膠酸水解酶的基因pelA和pelD同時受到抑制時,致病力才會降低,1個基因受到抑制不會影響致病力.編碼腐皮鐮孢菌果膠酸水解酶的基因有4個,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)2個和致病性有關(guān).Rogers等提出一個腐皮鐮孢菌致病的模型:當鐮孢菌接觸到寄主表面,組成型pelB和pelC基因開始轉(zhuǎn)錄,然后翻譯產(chǎn)物果膠誘導(dǎo)pelA基因表達,pelA產(chǎn)物協(xié)助鐮孢菌侵入寄主,最后pelD基因在寄主體內(nèi)表達.Shieh等研究黃曲霉菌發(fā)現(xiàn),當內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶基因pecA表達時,棉鈴上病斑很大.同樣,灰葡萄菌(Botrytiscinerea)侵染番茄和蘋果的葉和果實也存在類似情況.有些真菌的內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶是由多基因控制,抑制一個基因并不影響致病性.Gao等發(fā)現(xiàn)栗疫霉菌(Cryphonectriaparasitica)內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶的主效基因enpg-1突變后致病性并未改變.Isshiki等發(fā)現(xiàn)侵染柑橘果實的鏈格孢菌(Alternariacitri)內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶基因突變后致病力減弱,而侵染柑橘的另一鏈格孢菌Alternariaalternata多聚半乳糖醛酸酶基因卻與致病力無關(guān).他分析認為不同病菌有不同的侵染方式,侵染方式?jīng)Q定了是否需要這種酶參與侵染.致病力也受真菌生理活動的影響.Tonukari等對玉米旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)代謝物阻抑基因的調(diào)節(jié)因子研究發(fā)現(xiàn):當編碼調(diào)節(jié)因子的基因ccsnf1突變后,旋孢腔菌對玉米的致病力減弱.同時發(fā)現(xiàn)ccsnf1基因至少影響10個胞壁降解酶基因的轉(zhuǎn)錄.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中ccsnf1同源基因SNF1的作用與ccsnf1不同,該基因調(diào)節(jié)許多代謝活動,諸如糖原、甾醇和脂肪酸合成以及脂肪酸β-氧化,通過不同的生理活動控制酵母的致病力.Sweigard等在灰梨孢菌中克隆出pth1基因,該基因編碼葡萄糖阻抑調(diào)節(jié)因子,通過調(diào)節(jié)因子控制梨孢菌的致病力.這和釀酒酵母中的GRR1基因的功能很相似.3有關(guān)氰化物、氰化物和硫氰酸類的致病性研究寄主產(chǎn)生許多次生代謝物抵抗真菌的侵染,包括組成型代謝物和誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物抗毒素.真菌通過避開、降解或改變生理活動克服這些阻礙,以便順利在寄主體內(nèi)定植.皂角苷和堿性糖苷屬于組成型寄主防御物質(zhì).Bowyer等發(fā)現(xiàn)引起禾谷類全蝕病的禾頂囊殼菌(Gaeumannomycesgraminis)產(chǎn)生燕麥素酶分解燕麥根表皮細胞內(nèi)的皂角苷燕麥素A-1,編碼該酶的基因突變后禾頂囊殼菌也就失去了對燕麥的致病力.由于小麥不產(chǎn)生燕麥素,所以無論有無該酶,禾頂囊殼菌均可以致病.也有人不認為燕麥素酶是致病因子.Hernandez等研究番茄殼針孢菌(Septorialycopersici)的番茄素酶基因發(fā)現(xiàn),該基因序列與燕麥素酶基因有很高的同源性,但是抑制該基因表達并不影響殼針孢菌對番茄的致病性.同樣,Morrissey等在研究燕麥殼多孢菌(Stagonosporaavenae)發(fā)現(xiàn),抑制β-葡糖苷酶,一個專門分解2、6-脫葡糖燕麥素苷的酶,并未減少葉片上病害的嚴重度,而是發(fā)現(xiàn)另有兩個酶分解寄主的組成型防御物質(zhì).生氰糖苷類和β-硫代葡糖苷類也是寄主分泌的組成型防御物質(zhì).這兩類代謝產(chǎn)物多存在于寄主受傷部位,諸如有毒氰化物、腈類和硫氰酸類.也有人發(fā)現(xiàn)它們的防御作用并不明顯,許多含高濃度生氰葡糖苷和硫代葡糖苷的寄主照樣對病菌很敏感.降解氰化物的酶在致病中的作用還不清楚.Wang等對離體高粱細胞研究發(fā)現(xiàn)膠尾孢菌(Gloeocercosporasorghi)氰化物水解酶被抑制后該菌對氰化物的敏感性增強,但是在栽培的高粱上卻并不如此,抑制酶活性后并不影響致病力.真菌含有降解植物抗毒素的酶,其中一些酶的部分基因已被克隆.Wasmann和VanEtten研究叢赤殼菌(Nectria)發(fā)現(xiàn)6個豌豆素脫甲基酶PDA1-6基因中,PDA1基因突變引起病害嚴重度降低,另外幾個基因的作用還不清楚.該酶可以降解植物抗毒素-豌豆素.PDA1基因大小是1.6Mb.如果丟失該基因的染色體,叢赤殼菌的致病力將大為降低.最近,Han等研究PDA1發(fā)現(xiàn)序列周圍有3個潛在的致病基因簇PEP1、PEP2和PEP5.每個基因簇稱作一個“致病島”(pathogenicityisland),這與細菌中很相似.當3個基因被構(gòu)建到其它菌株,就會增強工程菌的致病性.數(shù)據(jù)庫中查不到與PEP1和PEP2相匹配的序列;PEP5與多藥物因子轉(zhuǎn)移蛋白基因序列很相似.另外,Covert等也在叢赤殼菌中鑒定出4個基因MAK1-4負責(zé)編碼降解鷹嘴豆植物抗毒素的酶.抑制MAK1基因表達,叢赤殼菌致病性就會減弱.當MAK1構(gòu)建到其它菌株后也會增強該菌的致病力.與PDA1基因不同的是,丟失MAK1染色體的菌株與MAK1基因突變的菌株比較,致病力差異不大.轉(zhuǎn)運蛋白對真菌致病性有重要影響.有些轉(zhuǎn)運蛋白基因突變后,真菌的代謝過程發(fā)生改變造成無法泵出寄主毒素.Urban等發(fā)現(xiàn)灰梨孢菌ATP盒式(ATP-bindingcassette,ABC)轉(zhuǎn)運蛋白基因ABC1突變后,梨孢菌致病性就會喪失.有毒化合物和植物抗毒素可以誘導(dǎo)ABC1基因表達.最近,Schoonbeek等發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因BcatrB突變后增加了對葡萄藤中的植物抗毒素—白藜蘆醇的敏感性.叢赤殼菌PEP5基因和多藥物因子轉(zhuǎn)移蛋白基因序列同源,而且該基因緊鄰?fù)愣顾孛摷谆富虮砻魉赡茉诒贸鐾愣顾刂邪l(fā)揮作用.灰梨孢菌pth9非致病突變主要是缺乏海藻糖酶,因為該酶調(diào)節(jié)細胞內(nèi)海藻糖的濃度,抵抗寄主體內(nèi)脅迫環(huán)境,促進孢子萌發(fā).灰梨孢菌pth2突變體缺乏肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶,該酶轉(zhuǎn)移脂肪酸乙酰CoA到線粒體.營養(yǎng)狀況也影響著真菌侵染.基因突變后,真菌變成營養(yǎng)缺陷型從而失去致病能力.Sweigard等發(fā)現(xiàn)灰梨孢菌非致病突變是因為咪唑甘油磷酸脫氫酶基因pth3上插入了一段DNA,造成組氨酸無法合成.通過限制酶介導(dǎo)的插入技術(shù),在灰梨胞菌中發(fā)現(xiàn)了非致病甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型.Kahmann和Basse發(fā)現(xiàn)玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)營養(yǎng)缺陷型和喪失致病性有直接關(guān)系.尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)精氨酸營養(yǎng)缺陷型也沒有致病力.Bailey發(fā)現(xiàn)小禾殼多孢菌(Snodonum)中鳥氨酸脫羧酶基因突變導(dǎo)致產(chǎn)生非致病小種.也有些真菌營養(yǎng)缺陷型可以誘導(dǎo)致病基因表達.這些基因除致病外可能還有其它的作用.最近,Segers等克隆出黃枝孢菌(Cladosporiumfulvum)2個饑餓誘導(dǎo)基因—乙醇氧化酶基因Aox1和乙醛脫氫酶基因Aldh1.當這兩個基因突變后,Aox1-小種產(chǎn)孢量減少,生長緩慢;但是,Aldh1-小種不同,產(chǎn)孢量和生長未發(fā)生變化.乙醇氧化酶的作用還不清楚.據(jù)認為負責(zé)分解寄主發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇以保持氧化還原平衡.4toxf基因真菌產(chǎn)生毒素使寄主細胞的正常生理功能失調(diào)或直接殺死寄主細胞.根據(jù)寄主范圍,真菌毒素分為非專化性毒素(nonspecifictoxins)和寄主?；远舅?host-specifictoxins).腔菌綱真菌大多數(shù)都產(chǎn)生寄主?；远舅?相比較而言,真菌毒素比較容易測定.毒素基因常常成簇存在,但并非所有成簇的基因都與毒素有關(guān),并且有些毒素基因發(fā)生改變,真菌仍能致病.譬如,玉米旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)合成HC-毒素基因.HC-毒素合成涉及到多個基因,這些基因成簇存在,大小是600kb,簇上至少有6個基因的重復(fù)單位.與HC-毒素產(chǎn)生有關(guān)的基因主要包括:HTS1基因,編碼一種多肽合成酶,該酶負責(zé)將4個氨基酸殘基裝配成多肽四聚體構(gòu)成HC-毒素,而且裝配過程不需要核糖體;TOXC毒素基因,負責(zé)編碼脂肪酸合成酶β-亞基;TOXF基因,編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶,該酶是合成毒素和致病所必須的;TOXG基因,編碼丙氨酸消旋酶蛋白,該蛋白為HC-毒素提供丙氨酸D-型異構(gòu)體.TOXG基因所有拷貝突變后,組成HC-毒素的氨基酸將改變,但突變體仍可致病;TOXEp基因,屬于調(diào)節(jié)基因,調(diào)控TOXA、TOXC和TOXD表達;TOXA基因,編碼HC-毒素分泌蛋白;TOXD的功能還不清楚.致病型鏈格孢菌(Alternariaalternata)分泌寄主?；远舅?Johnson等在日本梨和蘋果上發(fā)現(xiàn)AK-毒素和AM-毒素是鏈格孢菌分泌的致病因子.已經(jīng)克隆出合成AK-毒素的2個基因AKT1和AKT2.合成鏈格孢菌毒素的基因?qū)儆谝粋€基因組.最近,Tanaka和Tsuge對AKT-1和AKT-2的側(cè)翼測序后發(fā)現(xiàn)了另2個基因AKTR-1和AKT3-1,推測這2個基因也和毒素合成有關(guān).通過靶標突變阻抑2個基因表達將產(chǎn)生非致病性鏈格孢菌小種.燕麥草核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)寄主專化性毒素ToxA或Ptr分子量很小,只有13kD,該菌在感病小麥品種上引起黃褐色的病斑.體外重組發(fā)現(xiàn)Ptr基因在大腸桿菌中也產(chǎn)生寄主?；远舅?通過重組將ToxA基因?qū)隩oxA-真菌中,轉(zhuǎn)化的真菌就會對小麥有致病性.最近,在燕麥草核腔菌中新克隆出一個編碼寄主?；远舅氐幕騎oxB(6.6kDa),該基因在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中異源表達也表現(xiàn)毒性.單孢菌素(trichothecines)屬非專化性毒素.赤霉菌和露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)可以分泌這種毒素.Tri5基因是控制單孢菌素合成的第一步,阻斷該基因表達將導(dǎo)致虱狀赤霉(Gpulicaris)在歐洲防風(fēng)上致病力下降.在玉蜀黍赤霉(Gzeae)上也造成同樣的結(jié)果.缺乏單孢菌素的禾谷類鐮孢菌對玉米的致病力下降.Brown等從禾谷類鐮孢菌和擬分枝孢鐮孢菌中克隆出11個與單孢菌素合成有關(guān)的基因,其中10個基因成簇存在.有幾個已經(jīng)確定在單孢菌素合成中的作用,包括編碼Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的調(diào)節(jié)基因.5g蛋白亞基基因和map激酶基因的基因文化真菌依靠信號級聯(lián)放大對環(huán)境變化做出反應(yīng)并調(diào)整基因表達.侵染過程中涉及的信號基因主要包括異三聚體G蛋白基因、促細胞分裂活化蛋白激酶(MAP)基因以及依賴于cAMP蛋白激酶基因.阻斷信號基因表達將導(dǎo)致真菌致病性喪失或減弱,另一個影響是侵入后導(dǎo)致多營養(yǎng)效應(yīng)(pleiotrophiceffects).多營養(yǎng)效應(yīng)使我們很難決定致病性喪失是真菌的那些生理變化引起的.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因?qū)儆诓煌募易?從灰梨孢菌克隆出3個G蛋白α亞基基因和3個MAP激酶基因:G蛋白α亞基基因中只有magB和致病性有關(guān);MAP激酶的pmk1基因真菌突變體和mps1突變體不產(chǎn)生附著胞,也就沒有致病性;Hog1基因與pmk1和mps1不同,Hog1真菌突變體對滲透壓很敏感但仍產(chǎn)生附著胞并有致病性.雖然信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的氨基酸組成高度保守,但是不同真菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同,不同途徑之間的關(guān)系也不一樣,所以,同一基因在不同真菌突變后的效果是變化的.灰梨孢菌PMK1突變體仍產(chǎn)生正常的菌絲和分生孢子,但影響了附著胞形成,從水稻葉片傷口接種也不致病.CMK1是葫蘆刺盤孢菌的致病基因,序列和PMK1基因同源.Takano等發(fā)現(xiàn)CMK1-刺盤孢菌從傷口接種后致病性減弱,附著胞形成也受到影響,產(chǎn)孢能力下降,孢子萌發(fā)減少,附著胞褐化程度減弱.異旋孢腔菌CHK1基因與同源基因PMK1作用不同,PMK1-不影響生殖器官的接合(mating),而CHK1-的異旋孢腔菌不能受精,并且致病性也降低.真菌的生殖過程也受信號傳導(dǎo)影響.擔(dān)子菌諸如玉蜀黍黑粉菌(Umaydis)和大麥堅黑粉菌(Uhordei)在2個菌種接合后的雙核階段也可以致病.Herrera等發(fā)現(xiàn)黑粉菌中控制自宗配合和異宗配合的a、b兩個位點也間接控制著致病性.在單核的玉蜀黍黑粉菌中,bE1和bE2基因控制著致病性.這2個基因在玉蜀黍黑粉菌生活史循環(huán)中也起重要作用.所以,還不能將它們歸于致病基因.6基因型mdv1和mcd3在真菌中還發(fā)現(xiàn)了一些致病基因,這些基因在數(shù)據(jù)庫中找不到它的同源序列或者在寄主-病原菌互作中有獨特的功能.通過紫外線誘變,從玉蘭刺盤孢菌(Cmagna)中發(fā)現(xiàn)path-1致病基因,抑制該基因表達致病性喪失,但是該菌可以充當內(nèi)寄生菌在寄主體內(nèi)活動,保護寄主免受其它真菌的侵染.這從一個側(cè)面說明致病菌是從內(nèi)寄生菌發(fā)展而來.Redman等對14400個真菌侵染的寄主細胞進行插入突變掃描分析,發(fā)現(xiàn)了176個細胞表現(xiàn)非致病內(nèi)寄生菌表型,可以提供寄主不同程度的耐病性.從豆刺盤孢菌中發(fā)現(xiàn)CLTA1基因編碼蛋白含有鋅指結(jié)構(gòu)Zn[n]22[n]Cys6可以調(diào)控豆刺盤孢菌活體營養(yǎng)生長和死體營養(yǎng)生長之間的互換,所以屬于調(diào)節(jié)基因.禾生刺盤孢菌(Cgraminicola)非致病突變體在信號肽酶復(fù)合體亞基基因的啟動子區(qū)含有插入序列.該酶主要負責(zé)分泌信號蛋白,由于插入序列的影響,蛋白分泌減少.而分泌蛋白與寄主-病原菌互作有直接關(guān)系.CgDN3是另一類新的致病基因.在盤長孢刺盤孢菌(Cgloeosporioides)中編碼54個氨基酸殘基的分泌蛋白.該基因的突變種不能從葉面直接侵入熱帶豆科牧草,但從傷口仍可以入侵.通過顯微鏡發(fā)現(xiàn)接種點有大量的枯死細胞,類似于寄主過敏性反應(yīng).表明CgDN3基因是避開寄主表達過敏性反應(yīng)所必須的基因.在黃枝孢菌中發(fā)現(xiàn)2個分泌蛋白ECP1和ECP2.這2種蛋白由致病基因編碼.通過番茄單顯性位點cf-ECP2發(fā)現(xiàn)ecp2基因編碼的是無毒蛋白.在栽培6周的番茄苗上,任何一個基因的突變種接種將導(dǎo)致致病性降低.同時,用缺失ecp2基因的突變種接種2周齡的番茄不表現(xiàn)癥狀.7致病基因的研究通過突變技術(shù),目前已發(fā)現(xiàn)了79個真菌致病基因,大部分序列已錄入到數(shù)據(jù)庫.通過查詢數(shù)據(jù)庫,79個基因中有60個屬于新序列,其中在灰梨孢菌中就發(fā)現(xiàn)了16個.按照致病基因作用方式的不同,79個基因劃分成幾大類,包括侵染結(jié)構(gòu)基因、細胞壁降解基因、寄主內(nèi)環(huán)境應(yīng)答基因、毒素基因、信號級聯(lián)基因和其它一些基因.其中從子囊菌中發(fā)現(xiàn)了許多致病基因.從擔(dān)子菌的玉蜀黍黑粉菌中發(fā)現(xiàn)了許多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的致病基因.致病基因鑒定技術(shù)也很重要.隨機插入突變比靶標突變更容易獲得致病基因.當然,隨機突變技術(shù)也存在一些問題,諸如非標記背景突變、多插入位點和插入點不具專一性等.現(xiàn)在,利用根癌農(nóng)