第一章 植物基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)

第一章植物基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控自從孟德爾用不同表型的豌豆品種進(jìn)行雜交試驗(yàn)以探探討生物的遺傳規(guī)律以來，一部遺傳學(xué)的發(fā)展史反映了人類對基因不斷深化認(rèn)識的過程。特別在分子遺傳學(xué)誕生以后，有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、突變、表達(dá)、調(diào)節(jié)與克隆等方面的研究取得很大的進(jìn)展。這不但幫助生物學(xué)各分支學(xué)科找到了深化自己研究問題的思路，同時(shí)也為解決醫(yī)藥與農(nóng)業(yè)上的許多難題提供了新的技術(shù)與途徑。但是目前對基因仍有許多不夠了解的地方，還有許多基因尚未被克隆。這有待不同學(xué)科研究者的共同努力來完成。下面就近年有關(guān)植物中編碼蛋白質(zhì)的核基因的結(jié)構(gòu)，以及表達(dá)調(diào)控方面的一些進(jìn)展作一簡單的介紹。第一章植物基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控1.基因的結(jié)構(gòu)1.15’上游區(qū)1.25’非翻譯區(qū)1.3編碼區(qū)1.43’非翻譯區(qū)2.基因的表達(dá)調(diào)控2.1器官與組織專一性表達(dá)的基因2.2受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因2.3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)理1.基因的結(jié)構(gòu)1.15’上游區(qū)1.25’非翻譯區(qū)1.3編碼區(qū)1.43’非翻譯區(qū)克隆植物中核基因的方法在研究一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)之前，先要克隆到這個(gè)基因。目前常用來克隆植物中編碼蛋白質(zhì)的核基因的方法大致有以下幾種：①根據(jù)蛋白質(zhì)中所測出的部分氨基酸順序，合成一段與之相對應(yīng)的由三聯(lián)密碼組成的寡核苷酸，以此寡核苷酸為探針，從該植物的基因組文庫與cDNA文庫中分別釣出編碼此蛋白質(zhì)的基因與cDNA克隆。

②根據(jù)蛋白質(zhì)中所測出的氨基酸順序，合成一對或數(shù)對用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，以植物總DNA為模板，擴(kuò)增或分段擴(kuò)增出所要克隆的基因或基因片段、再以此DNA片段為探針，從基因組文庫與cDNA文庫中分別釣出編碼此蛋白的基因與cDNA克隆?？寺≈参镏泻嘶虻姆椒寺≈参镏泻嘶虻姆椒á廴绻虻漠a(chǎn)物不明確或蛋白質(zhì)不易提純而無法測序，但是知道該基因突變后所出現(xiàn)的表型改變，則可用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法來分離基因，該法是利用轉(zhuǎn)座子在染色體上能夠移動(dòng)的特性，分離出由于轉(zhuǎn)座因子插入而造成該基因表型改變的突變株，構(gòu)建突變株的基因組文庫，以轉(zhuǎn)座子作探針，從文庫中釣出能與轉(zhuǎn)座子探針雜交的陽性克隆。然后以該克隆中轉(zhuǎn)座子的旁鄰順序?yàn)樘结?，從野生型植物的基因組文庫中釣出雜交陽性的克隆，這就有可能得到所要克隆的基因。也有用農(nóng)桿菌中的T－DNA作插入突變來克隆基因的，原理相同?？寺≈参镏泻嘶虻姆椒á墁F(xiàn)在已有許多植物如水稻、番茄與擬南芥等的限制片段長度多態(tài)性圖譜〔RFLP）被建立，因此可利用這種圖譜，通過共分離分析找出與所要克隆基因有緊密連鎖關(guān)系的分子標(biāo)記，然后利用染色體步行或染色體著陸(chromosomelanding)策略，找到所要克隆的基因。克隆植物中核基因的方法⑤如果有該基因的突變株或該基因受某種因素誘導(dǎo)表達(dá)，則可利用mRNA的差異顯示法或減法克隆策略找到所要克隆的基因。除以上幾種方法外，也有人用其他生物中已被克隆的同源基因的順序作探針或據(jù)此合成引物，從所研究的植物中克隆出同源的基因。在克隆到基因與cDNA后，即可對它們進(jìn)行測序，并將基因的全順序與相應(yīng)的cDNA順序作比較，就可以初步了解該基因結(jié)構(gòu)的概況，如基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的位置，內(nèi)含子的數(shù)目、位置及其長度，終止密碼子與加po1yA信號的位置等。通過基因的cDNA克隆在細(xì)菌細(xì)胞中的高表達(dá)，以純化出它所編碼的蛋白質(zhì)，在測出該蛋白質(zhì)氨基端的部分氨基酸順序后，即可確定基因的翻譯起始密碼子，并推測出基因所編碼蛋白質(zhì)中的氨基酸順序與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量Mr。近年來，很多科學(xué)家對植物基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明它們與其他真核基因的結(jié)構(gòu)很相似。下面將他們對植物基因中4個(gè)區(qū)域結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果簡述如下：回1之目錄1.15’上游區(qū)這是指基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5’端上游包括啟動(dòng)子在內(nèi)的一段很長的區(qū)域，其中包含著與基因轉(zhuǎn)錄起始與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的許多元件。這個(gè)區(qū)域在結(jié)構(gòu)上有以下幾點(diǎn)值得注意。（1）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（2）TATAbox、CAATbox（3）順式作用元件（1）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)Joshi曾比較了79個(gè)高等植物基因啟動(dòng)區(qū)的DNA順序，推衍出在基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近的一致順序(consensussequence)是CTCATCA。當(dāng)中的一個(gè)A是轉(zhuǎn)錄起始的核苷酸，一般都將此核苷酸編號為+1位。轉(zhuǎn)錄本中的核苷酸位置均以正數(shù)表示，而A的5’上游區(qū)非轉(zhuǎn)錄核苷酸則以負(fù)數(shù)表示，A的兩邊通常是嘧啶核苷酸。（2）TATAbox、CAATboxJoshi的總結(jié)中還指出，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－32±7核苷酸對(bp)處有一段一致順序TCACTATATAG，簡稱為TATAbox，這些順序?qū)NA聚合酶Ⅱ準(zhǔn)確地使基因起始轉(zhuǎn)錄是必需的。在TATAbox上游-75bp附近常有一致順序GC(T／C)CAATCT，簡稱CAATbox．這些順序有增強(qiáng)基因特錄的作用。在有些植物基因中．沒有明顯的TATAbox，在另一些植物基團(tuán)中，AGGAbox替代了CAATbox

（3）順式作用元件在5’端遠(yuǎn)上游區(qū)域中．還存在對基因的表達(dá)有增強(qiáng)或阻遏作用的順序、決定基因在特定時(shí)空表達(dá)的順序以及對激素或外界脅迫有應(yīng)答作用的順序，由于這些順序?qū)虮磉_(dá)起調(diào)控作用，因此統(tǒng)稱為調(diào)控元件，又由于它們與基因位于同一條DNA鏈上，故又稱順式作用元件(cis－actingelement)。有些研究論文中提到的啟動(dòng)子有時(shí)也指包括了這些元件在內(nèi)的很長一段區(qū)域1.25’非翻譯區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到翻譯起始密碼子之間的一段順序被稱為5’非翻譯區(qū)。該區(qū)的5’端是前體mRNA加帽(7-甲基鳥嘌呤核苷）的位點(diǎn)。有些基因的5’非翻譯區(qū)中還有一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)與翻譯起始密碼子的旁鄰順序?qū)Ψg的效率都有影響。此外在有些值物基團(tuán)的5’非翻譯區(qū)中還鑒定出有內(nèi)含子存在。如在Ubiquitin基因、Sh基因、Actin基因、Ashl基因與Wx基因的5’非翻譯區(qū)中均有內(nèi)含子存在，且這些內(nèi)含子都有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用。1.3編碼區(qū)這是指從翻譯起始密碼列終止密碼之間的一段區(qū)域，或者說是指這一區(qū)域中的所有外顯子部分。（1）Kozak比較了47種植物基因與植物病毒基因中翻譯起始位點(diǎn)附近的23個(gè)核苷酸，除了一個(gè)基因例外，其余的都是從5’端的第一個(gè)AUG作為翻譯起始密碼子的。例外的是菜豆的凝集素基因，它的轉(zhuǎn)錄本5’端有4個(gè)AUG，但彼此的讀碼框不同?？赡苡捎谇懊?個(gè)AUG的旁鄰順序不適宜核糖體的識別而不被使用，第4個(gè)AUG才是真正的翻譯起始密碼子。1.3編碼區(qū)（2）關(guān)于編碼區(qū)外顯子中4種核苷酸的比例，Murray統(tǒng)計(jì)了54種單子葉植物基因與3種雙子葉植物基因，總結(jié)出單子葉植物基因的AU含量為54％，雙子葉植物基因中AU含量為43％。主要的差別是發(fā)生在密碼子的第3個(gè)堿基上，雙子葉植物基因?qū)、U、C、G4種堿基的選用機(jī)率基本相似，而單子葉植物基因則偏向于選擇A與U。1.3編碼區(qū)（3）像其他真核基因一樣，植物基因的編碼區(qū)中也常有數(shù)目不等的內(nèi)含子，而且有些編碼區(qū)中的內(nèi)含子也有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用。（4）有些真核基因中的一個(gè)外顯子正好對應(yīng)此基因所編碼蛋白質(zhì)中的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，因此有人推測在基因演化過程中，一個(gè)內(nèi)含子可能會帶著相鄰的外顯子在基因間飄移，從而構(gòu)成由不同結(jié)構(gòu)域組成的不同蛋白質(zhì)分子。1.43’非翻譯區(qū)這是指轉(zhuǎn)錄本中終止密碼子后面的一段順序，這段順序中也有一些調(diào)控元件，它們對mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的效率均起重要的調(diào)節(jié)作用。（1）Angenon等分析了748種植物基因中圍繞終止密碼子的18個(gè)核苷酸順序，總結(jié)出所有3種已知的終止密碼子都能被植物基因用作翻譯終止訊號，但使用的比例則因植物的不同而有差別。單子葉植物基因使用UGA作為終止密碼的占46％，UAA與UAG的分別占28％與26％，而雙子葉植物首選UAA占46％，而用UGA與UAG的分別為36％與18％，而琥珀密碼子UAG選用的百分比最低。（2）在mRNA末端有1或2個(gè)加polyA信號，多數(shù)植物基因均為AAUAAA，有少數(shù)基因其中的個(gè)別核苷酸有不同。2．基因的表達(dá)調(diào)控在植物的一個(gè)生命周期，即從種子胚到下一代種子胚的形成過程中，要經(jīng)過許多不同的發(fā)育階段與形成許多不同的組織與器官。這些過程都是與基因時(shí)空專一性表達(dá)密切相關(guān)的。同時(shí)，植物的生長與發(fā)育也離不開光、溫度等外界環(huán)境，而干旱、水澇、鹽堿、甚至病蟲害的侵襲等也會影響植物的正常生長與發(fā)育。因此，弄清基因時(shí)空表達(dá)以及環(huán)境因素如何誘導(dǎo)基因表達(dá)的分子機(jī)理在理論上與實(shí)際應(yīng)用上都有重要的意義。2．基因的表達(dá)調(diào)控2.1器官與組織專一性表達(dá)的基因2.2受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因2.3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)理2.1器官與組織專一性表達(dá)的基因一般用于確定某個(gè)基因在何種組織中專一表達(dá)的方法有以下幾種：（1）以基因編碼區(qū)中的一段順序?yàn)樘结?，與從不同組織或器官中抽提出的總RNA進(jìn)行Northern雜交。（2）將待測基因的啟動(dòng)子(包括5’遠(yuǎn)上游區(qū))DNA與一種報(bào)告基因的編碼區(qū)及3’端終止區(qū)連接，建成融合基因，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物并得到再生植株后，用組織化學(xué)或其他分析方法，檢測該報(bào)告基因在轉(zhuǎn)化植株的何種組織與細(xì)胞中表達(dá)。常用的報(bào)告基因有GUS基因，CAT基因與LUS基因等。（3）將基因所編碼的蛋白制備出抗體，對植物的不同組織切片進(jìn)行免疫原位雜文。近年來用上述方法已初步確定了一些在不同植物的各種組織中專一性表達(dá)的基因，現(xiàn)各舉一例介紹如下：在營養(yǎng)器官中：（1）編碼Rubisco小亞基的rbcS基因。主要在葉子的葉肉細(xì)胞、葉表面的保衛(wèi)細(xì)胞，中脈與綠色組織細(xì)胞中表達(dá)。（2）編碼富含羥基脯氨酸的糖蛋白的HRGP基因。此種糖蛋白是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，有防御病菌感染的作用，主要在莖的柵狀細(xì)胞、表皮細(xì)胞與滴漏細(xì)胞中表達(dá)。（3）編碼S－腺苷甲硫氨酸合成酶并參與多胺與乙烯生物合成的5’Sam-1基因。主要在維管組織的木質(zhì)部、韌皮部，厚壁組織與根的皮層中表達(dá)。在生殖器官中：

(1)P2

基因。只在雄蕊的成熟花粉與花粉管中表達(dá)，它所編碼的蛋白與聚半乳糖醛酶有同源性，推測此蛋白參與花粉管萌發(fā)與生長時(shí)的果膠解聚作用。(2)def基因。它是金魚草中編碼一種轉(zhuǎn)錄因子的基因，該基因發(fā)生突變后即造成金魚草的雄性器官轉(zhuǎn)換成不正常的雌性器官，它只在花器官的雄蕊中表達(dá)。(3)PAL2基因。它編碼苯丙氨酸解氨酶，參與花色素的合成，只在花瓣中表達(dá)。在種子中：(1)編碼大豆貯藏蛋白的的Gy4基因。它只在胚乳組織中表達(dá)。(2)O2基因。它是玉米中編碼一種轉(zhuǎn)錄因子的基因，該因子調(diào)節(jié)玉米醇溶蛋白基因的表達(dá)、O2基因只在玉米的胚乳中表達(dá)。（奧帕克-2（Opaque－2），它是辛格爾頓（Singleten）發(fā)現(xiàn)的）在種子中：(3)編碼禾谷類α-淀粉酶的αAmyl基因。當(dāng)種子吸水后開始萌發(fā)時(shí)，該基因在糊粉層中表達(dá)。除了上述幾個(gè)例子外，近年來還鑒定出了一些專一在果實(shí)、塊莖與根瘤中表達(dá)的基因，此處不一一列舉。但要指出的是：①許多組織專一性表達(dá)的基因，往往也是發(fā)育階段專一性表達(dá)的基因。如一些貯藏蛋白基因。②有些外界因素會改變基因表達(dá)的部位。如土豆的ClassⅠpatatin基因，它編碼土豆的貯藏蛋白，主要在塊莖中表達(dá)，在葉與莖中不表達(dá)。但當(dāng)塊莖與腋生芽被除去后，該基因即在莖與葉柄中表達(dá)。此外蔗糖也可誘導(dǎo)此基因在葉與莖中表達(dá)。2.2受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因一些非生物性脅迫因素如高溫、低溫、干旱、水澇、鹽堿、重金屬離子與創(chuàng)傷以及一些生物性脅迫因素如致病菌的感染與根瘤菌的入侵等均能誘導(dǎo)植物基因的表達(dá)，在脅迫因素與基因表達(dá)之間有一個(gè)很復(fù)雜的信號傳導(dǎo)過程，這里只介紹幾個(gè)受這些因素誘導(dǎo)的基因的例子。2.2受環(huán)境因素誘導(dǎo)而表達(dá)的基因2.2.1熱休克蛋白2.2.2低溫誘導(dǎo)的基因2.2.3水澇誘導(dǎo)的基因2.2.4脫水誘導(dǎo)的基因2.2.5創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因2.2.6病菌感染所誘導(dǎo)的基因2.2.1熱休克蛋白當(dāng)在正常溫度中生長的植物突然轉(zhuǎn)到40℃左右溫度的環(huán)境中時(shí)、有一組稱為熱休克基因很快表達(dá)。這些基因所編碼蛋白的Mr有80-90kD，65-75kD與15-30kD等幾種，一些植物中的熱休克基因已經(jīng)被克隆，并鑒定出了它們5’上游區(qū)中的一些調(diào)控元件，并同其他生物熱休克基因的調(diào)控元件在順序上有很高的同源性。2.2.2低溫誘導(dǎo)的基因有報(bào)道說將一些植物先在非冰凍的低溫中暴露一些時(shí)候，再轉(zhuǎn)到結(jié)冰的溫度環(huán)境中時(shí)，它們就能在一段時(shí)間內(nèi)耐受這種結(jié)冰的環(huán)境。研究表明在這種低溫處理過程中植物合成了一些蛋白。Kurkela等從擬南芥中克隆了冷誘導(dǎo)與ABA誘導(dǎo)的基因，并對它的特性進(jìn)行了研究。玉米mlip15基因編碼一個(gè)具有bZIP結(jié)構(gòu)域的蛋白,低溫、ABA或鹽均能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。2.2.3水澇誘導(dǎo)的基因玉米的根部遭到水淹時(shí)。有些基因很快就表達(dá)，這是植物對厭氧脅迫的一種應(yīng)答與適應(yīng)機(jī)制，在此種條件下表達(dá)的基因有醇脫氫酶基因Adh1、Adh2，蔗糖合成酶基因，醛縮酶基因等。在Adh1基出的5’上游區(qū)鑒定出了與厭氧誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件以及有關(guān)的反式作用因子。2.2.4脫水誘導(dǎo)的基因已在很多植物中克隆出了由于脫水的脅迫而誘導(dǎo)的基因，如大麥與玉米中的dehydrin基因、麥根中的WSP23基因與擬南芥中具有跨膜通道結(jié)構(gòu)蛋白的基因等。這些基因不但在植物脫水時(shí)被誘導(dǎo)，也能被脫落酸(ABA)所誘導(dǎo)，Takahashi等從水稻中克隆了Wsi18基因。水稻經(jīng)0.5mol·L-1甘露醇處理30min后該基因即被誘導(dǎo)表達(dá)，但不被ABA所誘導(dǎo)。此基因的順序與LEA4基因(lateembryogenesis－abundantgene)有部分同源性。2.2.5創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因當(dāng)植物受到機(jī)械損傷或蟲咬受傷后，一些基因往往被誘導(dǎo)表達(dá)。已從土豆中克隆出了創(chuàng)傷誘導(dǎo)的蛋白酶抑制劑Ⅱ基因與番茄中的extension基因。土豆蛋白酶抑制劑基因在正常條件下是在種子或塊莖中表達(dá)的，植物受傷后可在非儲藏器官中表達(dá)。此種蛋白質(zhì)性質(zhì)的蛋白酶抑制劑能抑制多種微生物或昆蟲蛋白酶的活性，但很少抑制植物來源的蛋白酶的活性。2.2.6病菌感染所誘導(dǎo)的基因病菌感染植物后，常會誘導(dǎo)一些被稱為致病相關(guān)基因(pathogenesis-relatedgene)的表達(dá)。其個(gè)有一些是編碼水解酶的基因，如幾丁質(zhì)酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因、以及參與木質(zhì)素或抗真菌的phytoalexin合成的如苯丙氨酸氨解酶基因與4-香豆酸∶CoA連接酶基因。這些基因的調(diào)控元件已被鑒定，鑒定信號受體與研究信號傳導(dǎo)途徑是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。2.3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)理基因的表達(dá)指基因在聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄成前體RNA，前體RNA經(jīng)過加工產(chǎn)生mRNA，以及mRNA翻譯成多肽并折疊成有活性蛋白質(zhì)分子的過程。上述過程的每一步驟都分別有許多包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA、DNA與RNA之間的相互作用以及受到許多順式作用元件與反式作用因子精密的、級聯(lián)式的調(diào)節(jié)。2.3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)理2.3.1轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)2.3.2轉(zhuǎn)錄后的加工2.3.3翻譯水平上的調(diào)節(jié)2.3.1轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)2.3.1.1染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄2.3.1.2DNA甲基化2.3.1.3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物2.3.1.4順式作用元件2.3.1.5反式作用因子2.3.1.1染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)由DNA與組蛋白組裝而成，其最簡單的樣式是核小體。核小體的核心是由二個(gè)相同的拷貝(每個(gè)拷貝中包含組蛋白H2A，H2B，H3與H4)組成的八聚體。DNA分子纏繞在組蛋白核心上．每個(gè)組蛋白核心上繞有二圈DNA分子，約長l46bp。第5種組蛋白H1結(jié)合在核小體兩端的DNA分子上，使鏈珠狀的染色質(zhì)變成在體積上進(jìn)一步壓縮了的線圈狀的染色質(zhì)。

2.3.1.1染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄在某種基因?qū)⒈晦D(zhuǎn)錄之前，該基因所在的一段染色質(zhì)的壓縮結(jié)構(gòu)會松散與展開。這就可以用DNase處理細(xì)胞核，然后以該基因的DNA片段作探針與從核中抽提出的總DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切成一定長的片段后進(jìn)行southern雜交來檢測。將要被轉(zhuǎn)錄的基因的所在區(qū)域由于染色質(zhì)的壓縮結(jié)構(gòu)已展開，故能被DNase消化。Southern雜交結(jié)果為陰性。在該基因不被轉(zhuǎn)錄的組織中．染色質(zhì)仍維持壓縮狀態(tài)。DNase酶不能水解DNA，雜交結(jié)果則為陽性。

2.3.1.1染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄最近有人從酵母中鑒定出一個(gè)由多種蛋白亞基組成的SWI－SNF復(fù)合體，其中包括SWI1（ADR6），SWI2（SNF2），SWI3，SNF5與SNF6等5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)。由于此復(fù)合物中的SWI2蛋白與ATPase以及helicase分子中有相似的形狀，因此有人推測此復(fù)合物可能與核小體DNA相互作用，并利用ATP水解所產(chǎn)生的能量來改變DNA－組蛋白的相互作用，并使1個(gè)或2個(gè)H2A－H2B二聚體從三元復(fù)合體中丟失，以使基因得以轉(zhuǎn)錄2.3.1.2DNA甲基化包括植物在內(nèi)，在所研究過的許多生物中，DNA的胞嘧啶堿基，特別是CpG順序上胞嘧啶分子中第5位點(diǎn)常被甲基化。在脊椎動(dòng)物DNA上的胞嘧啶有3％－6％被甲基化，而在維管植物DNA中，約有1／3胞嘧啶是被甲基化了的。對許多基因來說，被甲基化了的CpG主要位于5’上游調(diào)控區(qū)內(nèi)。有人推測，由于CpG上的C被甲基化．使DNA的大溝上產(chǎn)生了一個(gè)突起。因此局部地改變了轉(zhuǎn)錄因子所識別的信號，并妨礙轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合而影響基因的轉(zhuǎn)錄。2.3.1.2DNA甲基化用豌豆、小麥、大豆與花椰菜為材料所做的研究表明。順式作用元件上的胞嘧啶被甲基化后在體外即不能被轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合。有一些在特定發(fā)育階段才表達(dá)的基因，在未表達(dá)時(shí)，其5’上游的CpG是被甲基化的。當(dāng)達(dá)到發(fā)育階段時(shí)，CpG上的甲基會被去掉，基因即能表達(dá)。這表明甲基化與去甲基化是被某種因素調(diào)節(jié)的。也有報(bào)道指出，核小體中的H1組蛋白在體外優(yōu)先結(jié)合在被甲基化的DNA上，這樣會更有效地阻遏基因的轉(zhuǎn)錄2.3.1.3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)雖然能以小牛胸腺DNA為模板合成多聚核糖核苷酸分子。但它不能在體外對啟動(dòng)子有選擇性的起始轉(zhuǎn)錄，這表明除了PolⅡ外，還有其他因子參與有選擇性的轉(zhuǎn)錄起始。2.3.1.3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過層析分離法從酵母等細(xì)胞中逐步分離與鑒定出了被稱為通用轉(zhuǎn)錄因子(generaltranscriptionfactors,GTFs)中的8種蛋白，它們是TFⅡA、ⅡB、ⅡD、ⅡE、ⅡF、ⅡH、ⅡI與ⅡJ。這些GTFs能與PolⅡ有序地在基因的啟動(dòng)子上組裝，以形成在體外能使基因起始轉(zhuǎn)錄的起始復(fù)合物。其中TFⅡD與TBP蛋白、TAFs（與TBP蛋白相聯(lián)合的因子）一起形成一個(gè)多亞基復(fù)合物，結(jié)合在TATAbox上；TFⅡB是作為PolⅡ與結(jié)合在啟動(dòng)子TATAbox上TBP蛋白的橋梁，起轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇作用；TFⅡF結(jié)合在PolⅡ上，對PolⅡ所轉(zhuǎn)錄出的轉(zhuǎn)錄本有激活其延伸的作用；TFⅡH具有依賴于DNA的ATPase的活力與DNA解旋酶的活力。2.3.1.3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物另外，當(dāng)起始復(fù)合物形成時(shí)，結(jié)合在增強(qiáng)子元件上的轉(zhuǎn)錄因子會與TFⅡD蛋白相互作用，以增強(qiáng)PolⅡ轉(zhuǎn)錄基因的速率；SRB多肽是RNA聚合酶B的抑制蛋白，它能刺激基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄與被活化了的轉(zhuǎn)錄。最近發(fā)現(xiàn)PolⅡ分子中羧基端結(jié)構(gòu)域（CTD）在轉(zhuǎn)錄起始中也發(fā)揮著重要的作用，SRB多肽、GTFs以及一些尚未鑒定清楚的蛋白因子都通過CTD被錨錠在PolⅡ分子上。PolⅡ的CTD在有些條件下被磷酸化，推測磷酸化后的CTD可以使PolⅡ與起始復(fù)合物中的其他成分解離而離開啟動(dòng)子，因此CTD的磷酸化也在轉(zhuǎn)錄起始過程中起著控制與調(diào)節(jié)的作用。2.3.1.4順式作用元件順式作用元件是指基因5’端上游區(qū)中那些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的一些順序。除一般基因都有的TATAbox與CAATbox外，在遠(yuǎn)上游還有一些重要的調(diào)控元件，由于這些順序均與基因處于順式位置，即在同一條DNA鏈上，故冠以順式之名．以與不一定處于同一條DNA上編碼轉(zhuǎn)錄因子的反式作用因子的基因相區(qū)別。2.3.1.4順式作用元件鑒定出順式作用元件是研究基因表達(dá)調(diào)控中很重要的第一步。通常所用的方法是將從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始的5’上游區(qū)一定長度的DNA片段與報(bào)告基因編碼區(qū)及3’端區(qū)相連接，構(gòu)建成融合基因，然后用ExoⅢ外切核酸酶從5’上游區(qū)逐步向3’端消化，得到5’各有不同缺失長度的融合基因。通過轉(zhuǎn)化植物再生出含有上述不同缺失長度融合基因突變體的植株，用組織化學(xué)方法或其他方法，分析基因的5’上游區(qū)缺失到什么部位就不能使報(bào)告基因表達(dá)，或失去正確的時(shí)空表達(dá)專一性，或失去對外界因素脅迫的應(yīng)答能力。2.3.1.4順式作用元件找到調(diào)控元件存在的區(qū)域后，可從區(qū)域的5’端作進(jìn)一步小范圍的缺失突變，或從該區(qū)段中間的不同部位造成缺失突變，進(jìn)一步找出調(diào)控元件存在的準(zhǔn)確位點(diǎn)。然后可人工合成此位點(diǎn)內(nèi)的核苷酸順序，或?qū)⒋隧樞蛑械膫€(gè)別核苷酸調(diào)換，或?qū)⑦@段順序與突變后的順序分別連接在基礎(chǔ)啟動(dòng)子上游，以檢測它們是否能調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá)。此外還可用此段順序與細(xì)胞中的核蛋白作體外結(jié)合試驗(yàn)，或進(jìn)行足印分析試驗(yàn)，以弄清足印所顯示的順序是否與用上法所鑒定出的順序相同。當(dāng)然也可先用足印分析來確定核蛋白結(jié)合的核苷酸順序。下面介紹一些在植物基因5’上游區(qū)中鑒定出的幾種順式作用元件。

幾種順式作用元件（1）應(yīng)答光的元件（3個(gè)）（2）應(yīng)答激素的元件（4個(gè)）（1）應(yīng)答光的元件①從豌豆rbsS－3A基因（受光誘導(dǎo)表達(dá)）啟動(dòng)子5’上游區(qū)鑒定出BoxⅡ（GTGTGGTTAATATG）與BoxⅢ（AAACTTTATCATTT）。由于從煙草中分離出的反式作用因子GT－la或B2F可以結(jié)合在此元件上，因此也稱此元件為GT－1結(jié)合位點(diǎn)。如果將BoxⅡ中的某些核苷酸進(jìn)行突變，GT－1蛋白在體外試驗(yàn)中即不能再結(jié)合在突變了的BoxⅡ上。因此突變了的BoxⅡ啟動(dòng)子，在體內(nèi)也不再有使基因轉(zhuǎn)錄的作用。（1）應(yīng)答光的元件②從番茄的rbsS－3A基因啟動(dòng)子5’上游區(qū)中還鑒定出G－box（CCACGTGG）?，F(xiàn)在知道很多植物基因啟動(dòng)子的上游區(qū)中都存在G－box或類似G－box的元件,這些元件對多種外界環(huán)境信號有應(yīng)答作用，擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子GBF1－3能結(jié)合在此元件上。（1）應(yīng)答光的元件③從一些單子葉與雙子葉植物受光調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子上游區(qū)中鑒定出I－box（ATGATAAGG），并證明此元件對基因的受光調(diào)是很重要的的。但在一些非光調(diào)基因的啟動(dòng)子上游如TaMV35S啟動(dòng)子上游區(qū)中也鑒定出含GATAmotif的順序。有人在討論近年來對光調(diào)元件研究所取得的成果時(shí)認(rèn)為，雖然在許多光調(diào)基因的啟動(dòng)子上游區(qū)找到了一些順式作用元件，或在不同的基因中找到了相似的元件，但至今還沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)可通用的光調(diào)總開關(guān)，對受光誘導(dǎo)的基因來說，5’上游區(qū)中的許多元件都是很重要的。（2）應(yīng)答激素的元件①應(yīng)答ABA的元件：植物中已知有100多種基因可被外源的ABA所誘導(dǎo)表達(dá)，其中大部分是在種子發(fā)育后期表達(dá)的某因，或者是受外界環(huán)境因素脅迫時(shí)在營養(yǎng)組織中表達(dá)的基因。已鑒定出的能應(yīng)簽ABA的順式作用元件有小麥Em基因啟動(dòng)子上游區(qū)中的Em1A元件(GGACACGTGGC)，與從水稻rab16A基因啟動(dòng)子下游鑒定出的motifI元件（CCGTACGTGGCGC），以及從其他基因中找到的相似的元件。這些元件中都包含了G－box中的核心順序(CACGTG)。但是在不同的元件中，核心順序兩邊的順序則不完全相同，因此與之結(jié)合的反式作用因子的結(jié)構(gòu)與功能也不會完全相同。（2）應(yīng)答激素的元件②應(yīng)答GA3的元件：α－淀粉酶基因是受赤霉素（GA3）誘導(dǎo)而表達(dá)的。在大麥α－Amy6～4基因啟動(dòng)子的上游找到6個(gè)串聯(lián)重復(fù)的GARE元件（GGCCGA