電泳技術(shù)參考課件

電泳技術(shù)帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。1937年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳法(movingboundaryEP)”，成功地將血清蛋白質(zhì)分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5個主要成分，由于他的突出貢獻，1948年榮獲諾貝爾獎金。

50年代，許多科學(xué)家著手改進電泳儀，尋找合適的電泳支持介質(zhì)，先后找到濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉及瓊脂作為支持物。60年代，Davis等科學(xué)家利用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。這些技術(shù)具有設(shè)備簡單，操作方便，分辨率高等優(yōu)點。目前，電泳技術(shù)已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)以及與其密切相關(guān)的醫(yī)學(xué)、農(nóng)、林、牧、魚、制藥、某些工業(yè)分析中必不可少的手段。

第一節(jié)基本原理

一、泳動度

帶電顆粒在電場中泳動的速度稱遷移率或泳動度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt式中，U(也可以用m表示)為泳動度(cm2/V穝)；v為顆粒泳動速度(cm/s)；E為電場強度(V/cm)；l為支持物的有效長度(cm)；V為實際電壓(V)；t為通電時間(s或min)。電泳后通過側(cè)量V,t,d,l，即可計算出被分離物質(zhì)的泳動度。

泳動度與帶電顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，顆粒大小和形狀有關(guān)。一般說，凈電荷數(shù)量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，泳動度愈大。被分離的球形分子在電場中所受的力(F)為：

F=EQ

式中，E為電場強度，即每厘米支持物的電位降，Q為被分離物所帶凈電荷。根據(jù)Stoke定律，一球形分子在液體中泳動所受的阻力(摩擦力)F′為：

F′=6πrηv

式中，η為介質(zhì)粘度，r為分子半徑，v為分子移動速度。當(dāng)平衡時：F=F′，即EQ=6πrηv

∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη

由上式可見泳動度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關(guān)。

二、影響泳動度的因素

1.電場強度

電場強度是指每厘米的電位降，也稱電位梯度(電勢梯度)。電場強度越高，則帶電顆粒泳動越快。根據(jù)電場強度的不同，電泳可分為：(1)常壓(100-500V)電泳。其電場強度為2-10V/cm。分離時間較長，從數(shù)小時到數(shù)十小時，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。(2)高壓(2000-10000V)電泳。其電場強度為50-200V/cm，電泳時間很短，有時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。2.溶液pH

為使電泳時pH值恒定，必須采用緩沖液作為電極液，溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。對蛋白質(zhì)而言，溶液pH值離等電點(pI)越遠，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。因此分離某種蛋白質(zhì)混合液時，應(yīng)選擇一個合適的pH使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的差異。3.溶液的離子強度

緩沖液離子強度越高，則顆粒的電動電勢越小，泳動度也越小。一般最適合的離子強度在0.02-0.2之間。溶液離子強度(ionicstrength)的計算公式如下：

I=1/2Σcz2

式中，I為離子強度，c為離子的摩爾濃度(mol/L),z為離子價數(shù)，價數(shù)越高，則離子強度越大。如：求0.015mol/LNa2SO4的離子強度。

Na2SO4

2Na++SO42-

I=1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.0454.電滲

電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸附OH-離子帶負電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負極移動，會對顆粒的移動造成不良影響，故電泳時，電滲小些為好。

5.溫度電泳時會產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)粘度下降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高會使樣品中的生物大分子變性失活，因此電泳時，要控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。6.支持物

現(xiàn)代的電泳多在固體支持物上進行，使樣品中的不同組分形成不同的區(qū)帶，稱區(qū)帶電泳。電泳結(jié)束后，支持物可以很方便地進行染色等后續(xù)處理，因此，使用很廣泛。對支持物的一般要求是均勻，吸附力和電滲小，機械性能好，便于染色或紫外光下檢測，故最好透明，無紫外吸收。常用的支持物有濾紙，醋酸纖維素薄膜，淀粉凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠等。近年興起的毛細管電泳可不用支持物，并可與檢測裝置連接使用。此外，借助兩性電解質(zhì)的等電聚焦，電泳與免疫技術(shù)結(jié)合的免疫電泳，也是電泳的常用技術(shù)。第二節(jié)醋酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；?。將之溶于丙酮等有機溶劑中，即可涂布成均一細密的微孔薄膜，厚度約以0.1-0.15mm為宜。太厚吸水性差，分離效果不好；太薄則膜片缺少應(yīng)有的機械強度而易碎。目前，國內(nèi)有醋酸纖維薄膜商品出售，不同廠家生產(chǎn)的薄膜主要在乙?；?、厚度、孔徑、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等方面有所不同，但分離效果基本一致。醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有以下優(yōu)點：(1)分離效果好。對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無“拖尾”現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了定量測定的精確性。(2)快速省時。由于親水性較濾紙小，電滲作用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快，電泳時間短，一般電泳45-60min即可，加上染色、脫色，整個電泳完成僅需90min左右。(3)靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μL血清，故常用于檢測在病理情況下微量異常蛋白的改變。(4)應(yīng)用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。(5)易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于掃描定量及長期保存。由于醋酸纖維素薄膜電泳操作簡單、快速、價廉。目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。第三節(jié)瓊脂糖凝膠電泳

一、瓊脂糖凝膠的特點天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(agarose,約占80%)及瓊脂膠(agaropectin)組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。

目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下：(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。(4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1μg蛋白質(zhì)就可檢出。瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系

(1)DNA分子的大?。涸谀z中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。(2)瓊脂糖的濃度：如表4-1所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。2.核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)DNA(covalentlyclosedcircular，簡稱cccDNA)＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進入膠中，相對遷移率為0(Rm=O)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm＞O)，由此可見，這3種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。

3.電泳方法

(1)凝膠類型

用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而受到人們的歡迎。

(2)緩沖液系統(tǒng)

缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時，會造成膠熔化和DNA的變性。常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，濃度約為50mmol/L(pH7.5-7.8)，配制方法見附錄。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍。0.5×工作也可提供足夠的緩沖能力。

(3)凝膠的制備

以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。

(4)樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖溶解液內(nèi)含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。

(5)電泳

瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃，進行電泳。

(6)染色和拍照

常用熒光染料溴乙錠(EB)染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。三、印跡轉(zhuǎn)移電泳

生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，1975年，Southern創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜(NC膜)上，再進行雜交的方法，被稱為Southern印跡法，具體操作方法見實驗5-8。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設(shè)計了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再與相應(yīng)的抗體等配體反應(yīng)，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉(zhuǎn)移。1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上，稱Eastern印跡。目前國內(nèi)外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移的電泳裝置出售，使印跡轉(zhuǎn)移速度快、效率高、重復(fù)性好，應(yīng)用更加廣泛，儀器的使用方法可參照廠家說明書。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳，但轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉(zhuǎn)移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。進行印跡轉(zhuǎn)移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質(zhì)帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間不能有氣泡。適當(dāng)提高電壓或電流可以提高轉(zhuǎn)移速度，但亦會增加熱效應(yīng)，故電壓或電流不可過高。

四、交變脈沖電場凝膠電泳

一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動方向伸直，而轉(zhuǎn)向時間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。1983年，Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時間(外推為零的滯留時間)與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來，Carle等改進了電泳技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(periodicinversionoftheelectricfield)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一個水平式電泳槽和兩組獨立，彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板(10cm×10cm或20cm×20cm)呈45o置于中央，電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前進(圖4-1)。DNA分子凈移動方向與加樣線(圖中點線)垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬bp的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調(diào)，使用更加方便。此外，瓊脂糖平板常用于免疫擴散技術(shù)，和電泳技術(shù)相結(jié)合的多種免疫電泳。由于涉及免疫學(xué)技術(shù)，本章不作介紹。第四節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳一、聚丙烯酰胺凝膠的特點

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。

聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定。(4)幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。(6)凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。二、凝膠聚合的原理及有關(guān)特性

1.聚合反應(yīng)凝膠的聚合常用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED的堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活A(yù)cr單體，使其聚合成單體長鏈，在Bis作用下，聚合成網(wǎng)狀凝膠。堿性條件下凝膠易聚合，室溫下7.5%的凝膠在pH8.8時30min聚合，在pH4.3時約需90min。此外，核黃素亦可為催化劑，聚合需光照，故使用不多。2.凝膠孔徑的可調(diào)性及其有關(guān)性質(zhì)

(1)凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系：凝膠的孔徑、機械性能、彈性、透明度、粘度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。

T(Acr和Bis總濃度)%=[(a+b)/m]×100c(交聯(lián)劑百分比)%=[b/(a+b)]×100

其中a=Acr克數(shù)，b=Bis克數(shù)，m=緩沖液體積(mL)。a/b(W/W)與凝膠的機械性能密切相關(guān)。當(dāng)a/b＜10時，凝膠脆而易碎，堅硬呈乳白色；a/b＞100時，即使5%的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應(yīng)控制a/b=30左右。不同濃度的單體對凝膠性能影響很大，Davis的實驗發(fā)現(xiàn)Acr＜2%,Bis＜0.5%，凝膠就不能聚合。當(dāng)增加Acr濃度時要適當(dāng)降低Bis的濃度。通常，T為2%-5%時，a/b=20左右；T為5%-10%時，a/b=40左右；T為15%-20%時，a/b=125-200左右，為此Richard等(1965)提出一個選擇c和T的經(jīng)驗公式；

c=6.5?0.3T此公式適用于T為5-20%范圍內(nèi)的c值，其值可有1%的變化。在研究大分子核酸時，常用T=2.4%的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖。在T=3%時，也可加入20%蔗糖以增加機械性能，此時，并不影響凝膠孔徑的大小。(2)凝膠濃度與孔徑的關(guān)系：T與c不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān)系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動顆粒穿過網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有關(guān)，Bis占Acr總濃度5%時，孔徑最小。

(3)凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的相對分子質(zhì)量也不同，其大致范圍如表4-2在操作時，可根據(jù)被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標(biāo)準(zhǔn)膠)，因為生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。

3.影響凝膠聚合的因素

(1)Acr及Bis的純度：應(yīng)選用分析純的Acr及Bis，兩者均為白色結(jié)晶物質(zhì)，λ280無吸收。如試劑不純，含有雜質(zhì)或丙烯酸時，則凝膠聚合不均一，或聚合時間延長甚至不聚合，因而需進一步純化。Acr及Bis固體應(yīng)避光，貯存在棕色瓶中，因自然光、超聲波及γ射線均可引起Acr自身聚合或形成亞胺橋而交聯(lián)，造成試劑失效。Acr和Bis貯液的pH值為4.9-5.2，當(dāng)pH值的改變大于0.4pH單位則不能使用，因在偏酸或偏堿的環(huán)境中，它們可不斷水解放出丙烯酸和NH4+

而引起pH值改變，從而影響凝膠聚合。因此，配制的Acr和Bis貯液應(yīng)置棕色瓶中，4℃貯存，存放期一般不超過1-2個月為宜。

(2)AP、核黃素、TEMED：是凝膠聚合不可缺少的試劑，AP為白色粉末，核黃素為黃色粉末，應(yīng)在干燥、避光的條件下保存，其水溶液應(yīng)置棕色瓶中，4℃冰箱貯存，一般AP溶液僅能存放一周。TEMED為淡黃色油狀液，原液應(yīng)密閉貯于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但過量的AP和TEMED會引起電泳時燒膠和譜帶變形。應(yīng)選擇合適的配方使聚合在40-60min內(nèi)完成。(3)pH：堿性條件下聚合較快，但堿性過強時膠硬而脆，需高pH時應(yīng)減少AP和TEMED用量，制酸性膠可加AgNO3等促進聚合。(4)溫度：溫度高聚合快，但高濃度凝膠聚合時易產(chǎn)生小氣泡，低溫(5℃)聚合凝膠會變得脆而混濁，一般25-35℃聚合較好。(5)氧分子：氧分子阻礙凝膠聚合，故不含SDS的凝膠最好先抽真空脫氣，再加引發(fā)劑。三、PAGE原理

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；后者電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成，兩層玻璃板中排列順序依次為上層濃縮膠、下層分離膠。樣品液中加入等體積40%蔗糖，防止對流及樣品被稀釋。濃縮膠其作用是使樣品進入分離膠前，被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。分離膠緩沖液為pH8.9的Tris-HCl，大部分蛋白質(zhì)在此pH條件下帶負電荷。蛋白質(zhì)在此膠中由電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)完成分離。

1.樣品濃縮效應(yīng)(1)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性：凝膠中均有三羥甲基氨基甲烷(簡稱Tris)及HCl。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH值，是緩沖配對離子。HCl在任何pH溶液中均易解離出(Cl-)，在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。在電極緩沖液中，除有Tris外，還有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根(NH2CH2COO-)，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度僅有0.1%-1%，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH6.7或8.3時均帶負電荷向正極移動，遷移率介于快離子與慢離子之間，電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶。于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮成為極窄的區(qū)帶。當(dāng)進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；因此Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續(xù)前進。蛋白質(zhì)分子由于相對分子質(zhì)量大，被留在后面，由電荷效應(yīng)及分子篩效應(yīng)逐漸分成多個區(qū)帶。

(2)凝膠孔徑的不連續(xù)性：濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。2.分子篩效應(yīng)

大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)進入pH8.9的同一孔徑的分離膠后，分子小且為球形的蛋白質(zhì)分子所受阻力小，移動快，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。3.電荷效應(yīng)

在pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。目前，PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣，雖然電泳過程中無濃縮效應(yīng)，但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質(zhì)、酶、核酸等活性物質(zhì)變性失活，也顯示了它的優(yōu)越性。進行PAGE時，一般將膠灌在兩塊玻璃板之間，制成垂直板，垂直板電泳的優(yōu)越性有：(1)表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。(2)在同一塊膠板上，可同時進行10個以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。(3)膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。(4)膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描。(5)可進行雙向電泳。四、SDS原理

SDS即十二烷基硫酸鈉是陰離子去污劑，在水溶液中，以單體和分子團的混合形式存在，單體和分子團的濃度與SDS總濃度、離子強度及溫度有關(guān)，為了使單體和蛋白質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，需要采取低離子強度，使單體濃度有所升高。在單體濃度為0.5mmol/L以上時，蛋白質(zhì)和SDS就能結(jié)合成復(fù)合物；當(dāng)SDS單體濃度大于1mmol/L時，與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)；在低于0.5mmol/L濃度時，其結(jié)合比一般為0.4gSDS/g蛋白質(zhì)。由于SDS帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，因而可利用Mr差異將各種蛋白質(zhì)分開。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽分成單個亞單位。SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們在水溶液中的形狀近似雪茄形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸則與蛋白質(zhì)的Mr成正比。

目前，用SDS研究過的蛋白質(zhì)已有數(shù)百種，均證實此法測定蛋白質(zhì)Mr的可靠性?，F(xiàn)在，市場有標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。測定未知蛋白質(zhì)Mr時，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白及適宜的凝膠濃度，同時進行SDS，則可根據(jù)已知Mr蛋白質(zhì)的電泳遷移率和Mr的對數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得Mr。本方法有儀器設(shè)備簡單，操作方便，樣品用量少，耗時少(僅需一天)，分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì)Mr測定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來，除去SDS，還可進行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質(zhì)等方面的研究。

然而SDS也有其局限性，尤其是電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白、帶有較大輔基的蛋白(如糖蛋白)及一些結(jié)構(gòu)蛋白等測出的Mr不太可靠。如組蛋白F1，本身帶有大量正電荷，雖然結(jié)合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷，故用SDS測得的Mr為35000，而用其他方法測定的Mr僅為21000。因此要確定某種蛋白質(zhì)的Mr時，最好用2種測定方法互相驗證。尤其是對一些由亞基或兩種以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)，由于SDS及巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開，解離成單個肽鏈，因此測定結(jié)果只是單條肽鏈的Mr，還需用其他方法測定分子中肽鏈的數(shù)目。SDS在凝膠、電極緩沖液中均加進了SDS，蛋白質(zhì)樣品溶解液含有1%SDS和1%巰基乙醇，樣品液加樣前經(jīng)過100℃加熱4、5min。五、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳原理

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)pH＞pI時帶負電荷，在電場中向正極移動；當(dāng)pH＜pI時帶正電荷，在電場中向負極移動；當(dāng)pH=pI時凈電荷為零，在電場中既不向正極也不向負極移動，此時的pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(pI)。各種蛋白質(zhì)由不同的氨基酸以不同的比例組成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)，在電場作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動，形成pH梯度，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其pI的pH處，即不再泳動而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectricfocusing,簡釋IEF)。1.兩性電解質(zhì)載體

兩性電解質(zhì)載體是用多烯多胺和不飽和酸合成的脂肪族多氨基多羧基化合物的混合物，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的pI。目前，兩性電解質(zhì)載體由于生產(chǎn)廠家不同，合成方式各異而有不同的商品名稱，如Ampholine(LKB公司)、Servalyte(Serva公司)、Pharmalyte(Pharmacia公司)。一般溶液濃度為40%或20%，其pH范圍分別為：2.5-5，4-6.5，5-8，6.5-9，8-10.5，3-10等。用IEF分離蛋白質(zhì)并測定pI時可先選用pI3-10的兩性電解質(zhì)載體及同一范圍的標(biāo)準(zhǔn)pI蛋白，將其與未知樣品同時電泳，固定染色后，以pH值為縱軸，距陰極遷移距離(cm)為橫軸作出pH梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-2)，根據(jù)染色后未知蛋白質(zhì)遷移距離可推知其pI。為進一步精確測定未知物的pI，還可選擇較窄范圍的兩性電解質(zhì)進行電泳，以提高分辨率。如實驗時，無標(biāo)準(zhǔn)pI蛋白質(zhì)作標(biāo)定依據(jù)，則電泳后立即用表面微電極每隔0.5cm直接測定膠板的pH值，制作pH梯度曲線，染色后根據(jù)遷移距離推知某種蛋白質(zhì)的pI。兩性電解質(zhì)載體是IEF中最關(guān)鍵的試劑，它直接影響pH梯度的形成及蛋白質(zhì)的聚焦。因此，要選用優(yōu)質(zhì)兩性電解質(zhì)載體，在凝膠中，其終濃度一般為1%-2%。國內(nèi)生產(chǎn)的兩性電解質(zhì)載體色黃，導(dǎo)電性略差，但只要控制凝膠中終濃度不超過2%，電泳時電壓不要太高，仍可用于分析等電聚焦。為提高分辨率可適當(dāng)延長電泳時間。pH梯度的線性依賴于兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，選擇哪種pH梯度范圍的兩性電解質(zhì)載體，則與被分離蛋白質(zhì)的pI有關(guān)。2.電極溶液

應(yīng)選擇在電極上不產(chǎn)生易揮發(fā)物的液體作為電極緩沖液，陰、陽電極溶液的作用是避免樣品及兩性電解質(zhì)載體在陰極還原或在陽極氧化，其pH值應(yīng)比形成pH梯度的陰極略高，比陽極略低。值得指出的是不同廠家合成兩性電解質(zhì)的方法不同，應(yīng)根據(jù)說明書選用有關(guān)電極溶液。表4-4為Pharmacia公司生產(chǎn)的PharmalytepH梯度范圍與有關(guān)電極液。3.丙烯酰胺的聚合

在采用AP催化化學(xué)聚合時，為防止氧分子存在影響聚合，在加AP前應(yīng)對溶液脫氣。此催化系統(tǒng)在堿性條件下容易聚合，在酸性條件下(pH＜5)凝膠聚合比較困難，這可能是在酸性條件下，AP不能充分發(fā)生氧原子，使單體成為游離基，因而阻礙凝膠聚合，可在凝膠中加入1%的AgNO3促使凝膠聚合。凝膠聚合后，為防止酶的鈍化，在加樣前進行15-30min預(yù)電泳，然后將樣品放在其pI附近。在pH3-10、中性及堿性pH條件下，加入TEMED可加速凝膠聚合，但在pH＜5時無加速作用。TEMED為堿性物質(zhì)，在pH4.5以上能擴展PAG堿性端pH梯度，其擴增幅度與TEMED加入量有關(guān)。郭堯君等人實驗表明：在20mL凝膠溶液中，加入50μLTEMED，在距陰極0.3mm處可擴展0.7pH;加入100μLTEMED在陰極處能擴展1.3pH，也就是說pH3.5-9.5的兩性電解質(zhì)載體可擴展到pH3.5-11的梯度范圍。因此加入TEMED對堿性蛋白質(zhì)的分析極為有利，可用于分離細胞色素C、溶菌酶、組蛋白等。

4.樣品預(yù)處理及加樣方法

實驗證實鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。例如，將L-氨基酸氧化酶分別溶于不同濃度的NaCl,Tris-HCl及磷酸鈉緩沖溶液中，從IEF染色圖譜可看出高濃度及低濃度Tris-HCl緩沖液對pH梯度形成影響較小，而NaCl及磷酸鈉緩沖液干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進行IEF時，樣品應(yīng)透析或用SephadexG-25脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白質(zhì)在等電點附近或水溶液及低鹽溶液中，溶解度較低，則可在樣品中加入兩性電解質(zhì)，如加入1%甘氨酸或?qū)?%甘氨酸透析，雖然甘氨酸是兩性電解質(zhì)，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極矩作用增加蛋白質(zhì)的溶解性；也可將樣品溶解在含有2%兩性電解質(zhì)載體的溶液中，因它含有可反應(yīng)的氨基，并能除去氰酸鹽，此時樣品最好加在經(jīng)預(yù)聚焦的凝膠板的陽極側(cè)，因在pH5以下，既沒有氰酸鹽也沒有氨基甲?；嬖?。此外，還可在樣品及凝膠溶液中加入非離子去污劑如Tween80,TritonX-100,NonideP40等或加入相同濃度的尿素(4mol/L)，為防止氰酸鹽引起蛋白質(zhì)的氨甲?；?，含有尿素的樣品及凝膠板只能當(dāng)天使用。

加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍R250染色，加樣量可為50-150μg；如用銀染色，加樣量可減少到1μg。一般樣品濃度以0.5-3mg/mL為宜，最適加樣體積為10-30μL。如樣品很濃，可直接在凝膠表面加2-5μL；如樣品很稀，可加樣300μL。將其放在一特制的塑料小框中或用一小塊泡沫塑料及高質(zhì)量的濾紙或擦鏡紙吸取樣品放在凝膠表面。由于IEF是按蛋白質(zhì)pI分離，電泳后各種蛋白質(zhì)被濃縮并停留在其pI處。因此樣品可加在凝膠表面任何位置，既可將樣品放在中間，也可放在整個凝膠板中。電泳后均可得到同樣的結(jié)果。值得指出的是，對不穩(wěn)定的樣品可先將凝膠進行15-30min預(yù)電泳，使pH梯度形成，然后將樣品放在靠近pI的位置以縮短電泳的時間，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽、陰極的膠面上，以免引起蛋白質(zhì)變性造成條帶扭曲。一般加樣電泳半小時后，取出加樣濾紙以免引起拖尾現(xiàn)象。5.功率、時間、溫度等因素

功率是電流和電壓的乘積。在IEF電泳中，樣品的遷移越接近pI時，電流越小。為使各組分能更好地分離，就應(yīng)不斷增加電壓，縮短pH梯度形成和蛋白質(zhì)分離所需的時間。但過高的電壓會使凝膠板局部范圍由于高阻抗而過熱燒壞，為此，在電泳過程中，應(yīng)通冷卻水，水溫以4-10℃為宜，流量5-10L/min。避免使用過低的溫度，以免冷凝水滴形成。超薄板(0,5mm)TFE分辨率高就是因為易冷卻。IEF時間與功率取決于多種因素，如聚丙烯酰胺的質(zhì)量、AP和TEMED用量、膠板厚薄、兩性電解質(zhì)載體的導(dǎo)電性和pH范圍。窄pH范圍電泳時間比寬pH范圍時間長，這是因為在窄pH范圍蛋白質(zhì)遷移接近pI，帶電荷少，故遷移慢。為了提高分辨率，就要增加電壓，縮短電泳時間，防止生物活性喪失。IFE操作簡單，只要有一般電泳設(shè)備就可進行，電泳時間短，分辨率高，應(yīng)用范圍廣，可用于分離蛋白質(zhì)及測定pI，也可用于臨床診斷，農(nóng)業(yè)、食品研究，動物分類等各種領(lǐng)域。隨著其他技術(shù)的不斷改進，等電聚焦電泳也不斷充實完善，從柱電泳發(fā)展到垂直板，又進而發(fā)展到超薄型水平板等，還可與其他技術(shù)如SDS結(jié)合，進一步提高靈敏度與分辨率。六、聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳原理

雙向PAGE電泳是由兩種類型的PAGE組合而成。樣品經(jīng)第一向電泳分離后，再以垂直它的方向進行第二向電泳。如這二向電泳體系pH及凝膠濃度完全相同，則電泳后樣品中不同組分的斑點基本上呈對角線分布，對提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根據(jù)不同生物分子間等電點及相對分子質(zhì)量不同的特點，建立了以第一向為IEF，第二向為SDS-PAGE的雙向分離技術(shù)，簡稱為IEF/SDS；基本原理與IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，電泳結(jié)束后切取所需泳道用于第二向電泳，或在1mm內(nèi)徑的毛細管中進行第一向IEF，取出膠條用于第二向電泳。第一向電泳的方法同IEF-PAGE，只是制膠時要加入2%兩性電解質(zhì)和6mol/L尿素。第二向電泳時，先將SDS-PAG灌在垂直玻璃板之間，上部留2cm左右空間，待聚合后，將第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向膠之上，用載玻片將膠條輕輕壓直，加3μL1%溴酚蘭指示劑，用1%的瓊脂糖(用電極緩沖液配制)密封膠條，瓊脂糖凝固后即可電泳。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時，停止電泳。第二向電泳時，用梯度混合器將凝膠制成7.5%-15%的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。目前，已有5，000余種蛋白質(zhì)分采用IEF/SDS得到很好的分離，其高分辨率是各種類型單向PAGE及其他雙向PAGE所無法比擬的。因此，IEF/SDS雙向電泳已成為當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的實驗技術(shù)，可廣泛用于生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸酶解片段及核糖體蛋白質(zhì)的分離和精細分析，是蛋白質(zhì)組學(xué)的基本方法。隨著該技術(shù)的不斷改進與發(fā)展，其應(yīng)用范圍將更加廣泛。然而，此技術(shù)對某些堿性蛋白質(zhì)的分離卻有其局限性，因在第一向IEF的電泳體系中，含有高濃度的尿素，它的存在會使堿性區(qū)的pH梯度變得很窄而且不穩(wěn)定，可使堿性蛋白質(zhì)難以進入凝膠中或者易泳出凝膠外。因此，對堿性蛋白質(zhì)的分離分析應(yīng)采用其他方法。選出特定的斑點，可用于質(zhì)譜法測序用質(zhì)譜法測序：可分析微量的肽鏈，短肽在第一臺質(zhì)譜儀中經(jīng)電噴射電離，按荷質(zhì)比分離，依次在經(jīng)碰撞池被裂解成離子碎片，在第二臺質(zhì)譜儀中測出各個離子碎片的譜線，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用廣泛，但不能區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸。Edman化學(xué)降解法:用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀。若每次循環(huán)的準(zhǔn)確度為99%，經(jīng)60次循環(huán)，準(zhǔn)確度為：0.9960=0.54蛋白質(zhì)組學(xué)研究的其它基本方法根據(jù)核苷酸序列推定法：分離mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測定cDNA的核苷酸序列,再用遺傳密碼推定氨基酸序列。歐洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多萬條肽鏈的信息；美國國家生物醫(yī)學(xué)基金會主持的PIR