第二十至二十三教學單元-第8章微生物遺傳學-i-4

三、

接合(conjugation)通過細胞與細胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程1.接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和證實

1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復突變的機會，采用了雙重或三重營養(yǎng)缺陷型。該實驗是建立在不大可能同時發(fā)生兩種或三種回復突變的設(shè)想上的。證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）2.能進行接合的微生物種類主要在細菌和放線菌中存在。在細菌中，G－細菌尤為普遍，如E.coli、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬、固氮菌屬和假單胞菌屬等；放線菌中，以鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬最為常見，其中研究得最為詳細的是天藍色鏈霉菌（Streptomycescoeilcolor）。在不同屬的一些菌種之間也可發(fā)生接合現(xiàn)象，如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌間或沙門氏菌與痢疾志賀氏菌間。在所有對象中，接合現(xiàn)象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli。E.coli是有性別分化的，決定性別的是其中的F質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒還是合成性菌毛基因的載體。3.大腸桿菌的接合型與接合F＋菌株細菌遺傳重組單向過程和F因子的提出F－菌株F因子結(jié)構(gòu)圖:100kb，上面有編碼細菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合過程進行的20多個基因。

圖中黃色區(qū)域表示轉(zhuǎn)座子。Hfr菌株:細胞中的F質(zhì)粒整合到核染色體組上,與F－菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比任何已知的F＋與F－接合后的頻率高出幾百倍，這種“雄性”菌株稱為Hfr。在Hfr菌株與F-細胞進行接合時,OriT序列被缺刻-螺旋酶識別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子除先導區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞大多數(shù)仍然是F-（即不能使受體菌變成供體）。接合中DNA轉(zhuǎn)移過程有著穩(wěn)定的速度和嚴格的順序性。染色體上越靠近F因子先導區(qū)的基因，進入的機會就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時間就越早，頻率也高。中斷雜交（interruptedmating）技術(shù)和基因定位利用Hfr×F-的接合過程，在不同時間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細菌，然后分析受體細菌基因型，以時間(分鐘)為單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細菌染色體上基因順序的直接反映。左圖:不同Hfr菌株的形成方式，以不同的起點不同的順序轉(zhuǎn)移基因。（a）細菌染色體為環(huán)狀，可以不同的IS位點打開，F(xiàn)質(zhì)粒插入進去。（b）Hfr菌株的部分基因順序。大腸桿菌基因組很大（全部轉(zhuǎn)移需要100分鐘），其遺傳圖譜須用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成基因定位：通過遺傳重組等手段確定不同的基因在染色體上的位置及相對距離，從而獲得遺傳圖譜。連鎖的二基因間的距離與其共轉(zhuǎn)化，或共轉(zhuǎn)導的頻率成反比，因此，可根據(jù)二個基因被共轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)導的頻率判斷它們在染色體上的相對距離。

接合作用（中斷雜交）作圖只能判斷相距較遠的基因間的相對位置；轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化則可用于對相隔很近的基因進行定位；大腸桿菌遺傳圖譜目前對大腸桿菌的染色體已定位了1000多個基因F′菌株F′菌株:

Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細胞細胞基因通過F′和F-的接合而實現(xiàn)轉(zhuǎn)移的過程常稱為性導（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導，或F因子介導的轉(zhuǎn)導（F-mediatedtransduction）。F′所帶的基因可以與染色體發(fā)生重組；也可以繼續(xù)存在于F′因子上。F質(zhì)粒的四種存在方式及相互關(guān)系接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導）轉(zhuǎn)導(transduction)：由噬菌體介導自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細胞“接合”“轉(zhuǎn)導”及“自然轉(zhuǎn)化”這三種在自然界中存在的細菌遺傳重組過程各自的特點：a）外源DNA的來源及進入途徑有差異；b）決定因素也各有不同.如何設(shè)計實驗對三種途徑進行區(qū)分？四、原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）1.定義：通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體進行融合，以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。

融合子（fusant）意義：打破了微生物的種界界限，可實現(xiàn)遠緣菌株的基因重組；可使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機會；可與其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個單株中。

兩親本菌株的選擇和遺傳標記的制作（選擇不同的營養(yǎng)缺陷型，

（A:[a+b-],B:[a-b+]）對藥物抗性差異）

原生質(zhì)體的制備（高滲條件）

原生質(zhì)體再生融合（PEG、離心沉淀、電脈沖等）（測定再生率）

再生

融合子的檢出（直接檢出法和間接檢出法）

實用性菌株的篩選2.操作過程：五、微生物的基因組結(jié)構(gòu)1.基因組（genome）：

指存在于細胞或病毒中的一整套遺傳信息。（一個物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱）原核生物，多為單倍體（在一般情況下只有一條染色體）真核微生物，通常為雙倍體（多條染色體，啤酒酵母有16條染色體。）2.微生物與人類基因組計劃人類基因組計劃（HumanGenomeProject）1985年提出；1990年正式開始實施；2000年6月，工作草圖完成后基因組時代（PostgenomeEra

）微生物基因組測序工作是在人類基因組計劃的促進下開始的，最開始是作為模式生物，后來不斷發(fā)展，已成為研究微生物學的最有力的手段。被選擇進行全基因組測序的微生物：（1）人類基因組計劃中的模式生物重要性a）技術(shù)上從低等入手，建立技術(shù)、積累經(jīng)驗。通過對基因組結(jié)構(gòu)相對簡單生物，特別是微生物基因組的測序，對大規(guī)模測序的策略及技術(shù)進行檢驗，積累經(jīng)驗；b）理論上利用基因組在進化上的連續(xù)性進行比較研究通過對不同進化程度的基因組的分析、比較揭示更多的基本生物學信息，通過研究較為簡單的基因組而解答復雜的人類基因組問題。被選擇進行全基因組測序的微生物：（2）與人類生活關(guān)系密切的微生物（1）人類基因組計劃中的模式生物重要性醫(yī)療健康:重要的致病菌工業(yè)生產(chǎn):工業(yè)生產(chǎn)菌農(nóng)業(yè)種植:植物病原菌（3）對闡明生物學基本問題有價值的微生物一些古生菌：如Methanococcusjannaschii(詹氏甲烷球菌)等，它們是微生物世界多樣性的代表，它們的序列比較有助于找出其進化關(guān)系。3.微生物基因組結(jié)構(gòu)的特點3.1原核生物（細菌、古生菌）基因組（1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；鏈環(huán)狀的染色體在細胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式存在于細胞中，該小體稱為擬核(nucliod)，其上結(jié)合有類組蛋白蛋白質(zhì)和少量RNA分子，使其壓縮成一種手腳架形的致密結(jié)構(gòu)。例外：布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的染色體是線狀的3.1原核生物（細菌、古生菌）基因組（1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；（2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計的基因數(shù)微生物基因組DNA絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)、RNA；用作為復制起點、啟動子、終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識別和結(jié)合的位點等信號序列。一般不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。真核生物基因組的一個重要特點就是含有內(nèi)含子個別細菌(鼠傷寒沙門氏菌和犬螺桿菌)和古生菌的rRNA和tRNA的基因中也發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子或間插序列3.1原核生物（細菌、古生菌）的基因組（1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；（2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；（3）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)；（4）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝；（5）基因組的重復序列少而短；古生菌的基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細菌。但是信息傳遞系統(tǒng)(復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)則與細菌不同而類似于真核生物。操縱子（operon）：p195

功能相關(guān)的幾個基因前后相連，再加上一個共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點（啟動子、操縱基因等）在基因轉(zhuǎn)錄時協(xié)同動作。3.2真核微生物（啤酒酵母）的基因組（1）典型的真核染色體結(jié)構(gòu)；（2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)；啤酒酵母基因組大小為13.5×106bp，分布在17條染色體中。（3）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）和內(nèi)含子序列；（4）重復序列多。內(nèi)含子（intron）:真核細胞基因DNA中的間插序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA，但隨即被剪除而不翻譯。外顯子（e