甘藍(lán)型油菜雙隱性核發(fā)育系雄性不育兩株的細(xì)胞學(xué)觀察

甘藍(lán)型油菜雙隱性核發(fā)育系雄性不育兩株的細(xì)胞學(xué)觀察

油菜是世界著名的油料作物之一，其豐富的混合動(dòng)力具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用有多種途徑,其中細(xì)胞核雄性不育是其重要途徑之一。目前發(fā)現(xiàn)的油菜細(xì)胞核雄性不育類型有單基因顯性核不育、雙基因顯性核不育、單基因隱性核不育、雙基因隱性核不育和多基因隱性核不育,其中雙基因隱性核不育是一類重要的不育源,我國(guó)審定的“油研系列”、“蜀雜系列”油菜雜交種就是利用雙基因隱性核不育選育的。這些雜交種已在我國(guó)生產(chǎn)上大面積推廣,并取得了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。關(guān)于植物雄性不育花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察,前人已經(jīng)做了大量的研究工作。擬南芥、油菜、白菜、大豆、水稻、高粱等作物都有報(bào)道,其研究的重點(diǎn)在于確定花粉敗育的方式和時(shí)期。不同作物、不同類型的雄性不育系敗育的時(shí)期和特點(diǎn)各不相同。關(guān)于油菜雙基因隱性核不育材料敗育過(guò)程,楊光圣等已從顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行了觀察,初步明確了其敗育的時(shí)期及特點(diǎn)。但有關(guān)該材料花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂敗育行為還未見(jiàn)觀察報(bào)道。因此,本研究以甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核雄性不育兩用系為材料,利用涂片法和石蠟切片法對(duì)其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂和小孢子的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察,以進(jìn)一步明確小孢子敗育的時(shí)期及特點(diǎn),為油菜細(xì)胞核雄性不育機(jī)制的闡明和利用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菜雜交油研4號(hào)系97ab系列油菜雙隱性細(xì)胞核雄性不育材料為479AB。該材料是利用從貴州油料作物研究所張瑞茂惠贈(zèng)的油菜雜交種油研4號(hào)(系117AB系列雜交種)套袋自交后代中出現(xiàn)的雄性不育株與群體中可育株雜交,并連續(xù)多代兄妹交選育而成。在該群體中,表現(xiàn)不育的479A(基因型為ms1ms1ms2ms2)與表現(xiàn)可育的479B(Ms1ms1ms2ms2)僅存在一對(duì)基因差異,為近等基因系。1.2菊花發(fā)育時(shí)期的觀察油菜現(xiàn)蕾開(kāi)花后,在晴朗天氣從早上9點(diǎn)至15點(diǎn)每隔1h取不育株和可育株幼小花蕾,卡諾固定液(3酒精∶1冰醋酸)中固定12～24h后,轉(zhuǎn)入70%酒精,于4℃冰箱保存。先取花蕾的1枚雄蕊壓片,用丙酸—水合氯醛—蘇木精染色,顯微觀察確定每個(gè)花蕾花藥發(fā)育的時(shí)期;再取出該花蕾中其它花藥用70%、80%、90%、95%、100%酒精逐級(jí)脫水(各2h),二甲苯透明,并按常規(guī)石蠟切片程序進(jìn)行包埋,制成厚度為5μm的連續(xù)切片,用1%甲苯胺藍(lán)染色,阿拉伯樹(shù)膠干燥封片。2結(jié)果與分析2.1抽開(kāi)花期的完善從苗期至現(xiàn)蕾期,不育株和可育株沒(méi)有明顯的形態(tài)差異;抽薹開(kāi)花期,不育株和可育株的花朵從表型上較易加以區(qū)分,不育株的花絲短小,花藥小而干癟,其黃色發(fā)白,無(wú)粉;可育株花絲較長(zhǎng),花藥飽滿,呈黃色(圖1)。2.2花粉的形成過(guò)程可育株的花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)正常的減數(shù)分裂和兩次有絲分裂,形成成熟花粉粒。減數(shù)分裂:①終變期:染色體濃縮變粗,有交叉狀,圓形和棒狀的,19個(gè)二價(jià)體分散在整個(gè)核內(nèi),可清楚地看到所有的染色體;②中期Ⅰ:各二價(jià)體分散排列在赤道板近旁(圖2A)。③后期Ⅰ:配對(duì)的同源染色體彼此分離,走向細(xì)胞的兩極(圖2B)。④中期Ⅱ:兩套染色體都排列在細(xì)胞的赤道面上,形成互相垂直或平行的赤道板(圖2C)。⑤后期Ⅱ:每個(gè)染色體上的2個(gè)單體分開(kāi),分別走向細(xì)胞一級(jí),在細(xì)胞內(nèi)可看見(jiàn)4組染色體(圖2D)。⑥末期Ⅱ:在細(xì)胞內(nèi)形成4個(gè)新細(xì)胞核,染色體又解螺旋變?yōu)槿旧|(zhì),緊接著進(jìn)行胞質(zhì)分裂,同時(shí)形成新的細(xì)胞壁,產(chǎn)生4個(gè)子細(xì)胞,即四分體(圖2E)。單核期:小孢子從四分體釋放出來(lái)以后,便立即開(kāi)始花粉壁的形成(圖2F,G)。小孢子具有1個(gè)核,有的位于中間(圖2F),有的靠邊(圖2G)。隨著花粉的生長(zhǎng),出現(xiàn)液泡(圖2H),以后細(xì)胞內(nèi)含物增多,液泡消失。二核期:單核細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂形成一個(gè)大的營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)小的生殖核,營(yíng)養(yǎng)核居中,生殖核靠邊(圖2I)。三核期:此期的花粉具有三個(gè)核,即營(yíng)養(yǎng)核和兩個(gè)精核(即雄配子).兩個(gè)精核是由生殖細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂形成的(圖2J)。2.3認(rèn)識(shí)藥物為藥物顯身體的發(fā)育進(jìn)程與可育株相比,不育株的花藥只進(jìn)行了減數(shù)分裂,發(fā)育就此停止而沒(méi)有進(jìn)行有絲分裂。在不育株中也觀察到了減數(shù)分裂的各個(gè)時(shí)期(圖2K～圖2P),但在后期Ⅰ部分細(xì)胞出現(xiàn)了染色體橋(圖2L、M、N),而且最后形成的有四分體和其它超數(shù)的多分孢子,即5分孢子,6分孢子(圖2P),在同一胼胝質(zhì)膜內(nèi)的小孢子大小不等(圖2O)。在同一不育花藥的雄蕊中,各花粉母細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程不同步,分裂相從未分裂的,中期Ⅰ,中期Ⅱ,末期Ⅱ都可同時(shí)觀察到(圖2T)。另外,從整體來(lái)看不育株的發(fā)育較可育株晚一些.不育株發(fā)育到四分體時(shí)可育株已經(jīng)發(fā)育到單核后期甚至二三核期。單核小孢子及以后時(shí)期和可育株的也不同,小孢子從四分體釋放出來(lái)以后,胼胝質(zhì)很快分解了,但并沒(méi)有開(kāi)始花粉壁的形成,細(xì)胞質(zhì)開(kāi)始降解,最后變成一個(gè)無(wú)內(nèi)容物的空泡(圖2Q～圖2S)。2.4花粉粒不同發(fā)育時(shí)期為確定該不育材料敗育的細(xì)胞學(xué)時(shí)期,我們通過(guò)石蠟切片對(duì)不育株和可育株的花藥橫截面從造孢細(xì)胞,花粉母細(xì)胞,減數(shù)分裂,四分體,一直到成熟花粉粒各時(shí)期進(jìn)行了觀察比較。四分體時(shí)期,與可育株相比,除四分體外不育株還形成其它多分體,大小也不等;小孢子釋放后沒(méi)有形成細(xì)胞壁,而且細(xì)胞逐漸降解,隨之藥室也皺縮變形(圖2a、b、c、d)。3小培養(yǎng)區(qū)分鑒定對(duì)小東北部的同核減數(shù)分裂的影響關(guān)于油菜雄性不育花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征已經(jīng)有一些研究報(bào)道。余鳳群和傅廷棟曾根據(jù)雄性不育發(fā)生的時(shí)期及解剖學(xué)特點(diǎn),將其分成無(wú)花粉囊敗育型,花粉母細(xì)胞敗育型和小孢子敗育型。其中,花粉母細(xì)胞敗育又包括花粉母細(xì)胞死亡型,擬小孢子型和減數(shù)分裂異常型。雄配子的育性與花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程緊密相關(guān)。減數(shù)分裂是有性生殖生物形成配子的一種特殊的細(xì)胞分裂方式,分裂過(guò)程中,同源染色體有規(guī)律地分配到配子中,以保持世代之間遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定。本研究中,通過(guò)涂片法,我們觀察到油菜隱性核不育系減數(shù)分裂過(guò)程中一些新的異常行為。在后期Ⅰ,不育株部分細(xì)胞出現(xiàn)了染色體橋;最后形成的有四分體和其它超數(shù)的多分孢子;在同一胼胝質(zhì)膜內(nèi)的小孢子大小不一;在同一不育花藥的雄蕊中,各花粉母細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程不同步等異?，F(xiàn)象。這種現(xiàn)象與后期Ⅱ不均等分裂,及末期Ⅱ形成大小不等的核是相關(guān)的,或者說(shuō)是減數(shù)分裂時(shí)染色體及其斷片的不均等分配,末期Ⅱ形成多核和不均等核,繼而圍繞核所形成的小孢子便有大小之分。高粱中,Tsvetova觀察了顯性雄性不育突變體同一花藥中不同花粉母細(xì)胞分裂不同步的現(xiàn)象。楊守萍等發(fā)現(xiàn)大豆核不育突變體中染色體落后、染色體橋、染色體不均等分離、形成大小不等的多分體等異?，F(xiàn)象。湯澤生對(duì)航天誘導(dǎo)的番茄雄性不育株的研究結(jié)果顯示減數(shù)分裂也有類似異?，F(xiàn)象。呂琳?qǐng)?bào)道了木立蘆薈小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的異常情況。由此可見(jiàn),小孢子減數(shù)分裂異?？赡苁菍?dǎo)致油菜等一些作物小孢子敗育的重要原因之一。本研究得到的減數(shù)分裂異常的結(jié)果是前人在油菜上所未發(fā)現(xiàn)的,比楊光圣等的研究有更多的發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)油菜雙隱性細(xì)胞核雄性不育小孢子從胼胝質(zhì)中釋放以后,胼胝質(zhì)解體但小孢子沒(méi)有開(kāi)始花粉壁的形成,細(xì)胞質(zhì)也進(jìn)一步解體,這與楊光圣等的研究結(jié)果相一致。盧永根等觀察了水稻花粉及花藥壁發(fā)育的超微結(jié)構(gòu),認(rèn)為花粉壁發(fā)育異常與小孢子發(fā)育異常都會(huì)導(dǎo)致花粉敗育。本實(shí)驗(yàn)采用了常規(guī)的壓片和石蠟切片兩種方法,通過(guò)壓片得到的結(jié)果,除了減數(shù)分裂期發(fā)現(xiàn)的異常外,四