基于表面等離子體共振傳感器的生物傳感器核酸檢測(cè)方法

基于表面等離子體共振傳感器的生物傳感器核酸檢測(cè)方法

在空間任務(wù)的執(zhí)行過(guò)程中，由于輻射和反應(yīng)等因素的綜合影響，公民的免疫功能得到降低，探測(cè)器的濕熱環(huán)境適合于微生物的生長(zhǎng)和繁殖。因此，航空航天環(huán)境中的微生物對(duì)駕駛員健康和載人飛機(jī)系統(tǒng)的可靠性有更大的威脅。目前航天環(huán)境的微生物檢測(cè)仍以在空間對(duì)環(huán)境進(jìn)行樣品采集,任務(wù)結(jié)束后返回地面對(duì)微生物進(jìn)行鑒定為主,檢測(cè)過(guò)程滯后,無(wú)法對(duì)航天器內(nèi)的微生物污染及時(shí)采取相應(yīng)的處置措施,影響航天員的健康及航天任務(wù)的順利完成。如能實(shí)時(shí)、在線對(duì)航天環(huán)境的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè),對(duì)確保航天員的健康及工作效率具有極其重要的意義。目前生物傳感器技術(shù)憑借其實(shí)時(shí)、靈敏、快速的特點(diǎn)應(yīng)用廣泛,是建立空間實(shí)時(shí)微生物檢測(cè)系統(tǒng)的可選方法之一。其中,表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技術(shù)作為一種無(wú)需進(jìn)行樣品標(biāo)記、能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)生物分子之間相互作用的光學(xué)檢測(cè)方法,近年來(lái)發(fā)展迅速。該方法樣品用量少,靈敏度高,抗干擾能力強(qiáng),在核酸雜交、遺傳病診斷、基因突變研究及微生物檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用以SPR生物傳感器為技術(shù)核心的便攜式生物分子在線分析系統(tǒng)(portableonlinebio-moleculesanalyzer,POBA),通過(guò)將巰基修飾的寡核苷酸固化于傳感器表面作為探針?lè)肿?對(duì)溶液中的靶序列進(jìn)行檢測(cè),并通過(guò)對(duì)該檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行研究,為SPR生物傳感器技術(shù)應(yīng)用于微生物的實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)提供依據(jù)。探針?lè)肿幽さ闹苽浜蜋z測(cè)儀器POBA系統(tǒng)構(gòu)成圖見(jiàn)文獻(xiàn)。試劑6-巰基-1-己醇(6-mercapto-1-hexanol,MCH)購(gòu)于Sigma-Aldrich,其余試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司,實(shí)驗(yàn)中所用溶液組成如下:固化溶液,KH2PO41mol/L;雜交緩沖液,NaCl150mmol/L,Na2HPO420mmol/L,EDTA0.1mmol/L;再生溶液,HCl0.5mol/L。寡核苷酸序列合成于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。探針序列,5’-HS-T18-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’;互補(bǔ)寡核苷酸,5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3’;非互補(bǔ)寡核苷酸,5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。核酸分子膜的制備通過(guò)探針?lè)肿?’末端的巰基與傳感器金膜形成的硫-金共價(jià)鍵,完成探針?lè)肿釉诮鹉け砻娴墓袒?)傳感器金膜放入4%SDS中浸泡10min,將棉簽浸濕后輕輕擦拭金膜表面,純凈水沖洗后晾干。2)將傳感器置于支架上,使金膜處于水平位置,吸取100μl探針溶液(1μmol/L,固化溶液配制)滴于金膜表面并使之鋪平,室溫濕盒中固化2h,純凈水清洗后滴加100μl1mmol/LMCH(純凈水配制)于金膜表面,封閉傳感器表面的空余位點(diǎn)。核酸樣品檢測(cè)待測(cè)序列溶液恒速流經(jīng)傳感器表面,與探針?lè)肿影l(fā)生雜交反應(yīng),具體步驟如下:1)待測(cè)序列溶液(雜交緩沖液配制)注入檢測(cè)池5min;2)注入雜交緩沖液3min清洗測(cè)試面,以除去未結(jié)合的寡核苷酸分子。傳感器再生注入0.5mol/LHCl30s,使雜交雙鏈解聚,完成探針?lè)肿拥脑偕?進(jìn)入下一個(gè)檢測(cè)循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在室溫(25℃)下進(jìn)行,溶液注入通過(guò)蠕動(dòng)泵完成,流速控制在60μl/min,所檢測(cè)到的信號(hào),稱之為折射率(refractiveindex,RI),雜交反應(yīng)前后的RI差值代表傳感器表面結(jié)合靶序列的量。傳感器檢測(cè)限應(yīng)用傳感器表面固化的探針?lè)肿?按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原理檢測(cè)溶液中的靶序列,靶序列與探針結(jié)合后表現(xiàn)為折射率值的升高,結(jié)合靶序列的質(zhì)量與折射率的變化值正相關(guān)。傳感器特異性應(yīng)用1μmol/L非互補(bǔ)寡核苷酸溶液作為陰性對(duì)照進(jìn)行雜交,非互補(bǔ)核酸序列與傳感器表面探針無(wú)結(jié)合,引起的RI變化值可忽略(低于1.0×10-5)。傳感器檢測(cè)限將互補(bǔ)靶序列溶液倍比稀釋,濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125nmol/L,然后依次將樣品注入流通池進(jìn)行檢測(cè),所得的濃度-折射率曲線如圖1所示。從圖2中可見(jiàn),該曲線在0～62.5nmol/L濃度范圍內(nèi)呈線性分布,計(jì)算所得的最低檢測(cè)限為2.3nmol/L(對(duì)空白溶液進(jìn)行≥3次檢測(cè),計(jì)算3次結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差,以數(shù)值的3倍為縱坐標(biāo),曲線中所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)濃度值即為最低檢測(cè)限)。傳感器重復(fù)性與穩(wěn)定性應(yīng)用相同濃度(1μmol/L)互補(bǔ)靶序列進(jìn)行9次檢測(cè),所得RI結(jié)果的平均值為(10.52±0.37)×10-5,變異系數(shù)CV為3.5%。為了驗(yàn)證該核酸傳感器的穩(wěn)定性,應(yīng)用相同濃度(1μmol/L)互補(bǔ)靶序列重復(fù)進(jìn)行30次檢測(cè),將測(cè)試中靶序列與探針的雜交時(shí)間縮短為3min,所得RI結(jié)果的平均值為(7.84±1.16)×10-5,變異系數(shù)CV為14.7%。傳感器表面固化目前SPR技術(shù)應(yīng)用于微生物檢測(cè)領(lǐng)域主要針對(duì)特異性表面抗原,易受到微生物表面抗原變異的影響;而微生物基因組16SrDNA中的保守序列較為穩(wěn)定,變異程度低,在微生物診斷及種類鑒定方面具有優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中選用的探針是真細(xì)菌16SrDNA中的保守片段,以求應(yīng)用于下一步的微生物檢測(cè)工作。探針固化是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),本實(shí)驗(yàn)中將探針的5’端進(jìn)行巰基化修飾,通過(guò)該巰基與傳感器金膜形成硫-金共價(jià)鍵從成固化;一種探針固化方法也將傳感器的表面預(yù)先進(jìn)行葡聚糖修飾,依次將鏈霉親和素(streptoavidin)及生物素(biotin)化的探針與傳感器進(jìn)行交聯(lián),完成探針的固化。該兩種固化方法均可獲得適宜的探針密度,雜交反應(yīng)結(jié)果理想,但后者程序較復(fù)雜,影響因素較多,操作時(shí)間長(zhǎng),故本實(shí)驗(yàn)中采用巰基修飾探針的固化方法,直接簡(jiǎn)便,利于控制實(shí)驗(yàn)條件。在傳感器表面進(jìn)行寡核苷酸探針的固化通常存在2種問(wèn)題:1)探針在傳感器表面呈平鋪狀態(tài);2)互補(bǔ)靶序列在固相雜交中的空間位阻。固化過(guò)程中,探針?lè)肿渔溳^長(zhǎng),則探針?lè)肿油ㄟ^(guò)5’末端巰基固化的同時(shí),探針鏈上的氨基也可與金膜形成微弱的化學(xué)鍵,使探針?lè)肿釉诮鹉け砻嫘纬善戒伒臓顟B(tài),不利于靶序列與探針?lè)肿拥碾s交。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用MCH封閉金膜表面空閑位點(diǎn),該小分子與金膜形成穩(wěn)定的硫-金共價(jià)鍵而取代探針與金膜形成的微弱化學(xué)鍵,使探針?lè)肿釉诮鹉け砻娉手绷顟B(tài)而更有利于雜交反應(yīng)。探針合成過(guò)程中在巰基及探針序列間加入了18個(gè)T堿基,通過(guò)增加探針?lè)肿拥拈L(zhǎng)度,維系靶序列與探針?lè)肿与s交所必需的空間,又有效地增加了探針雜交部位與金膜表面的距離,降低了靶序列與金膜之間的空間位阻,更有利于靶序列與探針的雜交反應(yīng)。poba的系統(tǒng)特征本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法分析時(shí)間短,靶序列樣品檢測(cè)可在15min內(nèi)完成;靈敏度高,檢測(cè)下限可達(dá)2.3nmol/L,與國(guó)外實(shí)驗(yàn)室的10nmol/L檢測(cè)下限有較大程度的提高;特異性強(qiáng),與非互補(bǔ)序列雜交無(wú)折射率的變化,單堿基錯(cuò)配序列(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3’)與探針雜交,引起折射率的變化值僅為完全互補(bǔ)序列與探針雜交后折射率變化值的78.6%(結(jié)果未顯示),表現(xiàn)出較高