生物化學(xué)(上)實(shí)驗(yàn)

生物化學(xué)（上）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一、氨基酸的紙層析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)并掌握紙層析的原理和操作技術(shù)；2、掌握影響分配系數(shù)的因素。

3、學(xué)會(huì)分析未知樣品的氨基酸成分。二、原理濾紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。有機(jī)相流經(jīng)固定相支持物時(shí)，與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用Rf值表示：Rf＝原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離物質(zhì)結(jié)構(gòu)、溶劑系統(tǒng)的物質(zhì)組成等因素都會(huì)影響Rf值。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：

1、實(shí)驗(yàn)材料：谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品

2、儀器：(1)毛細(xì)管(2)電熱吹風(fēng)機(jī)(3)層析缸(4)層析濾紙

（5）小型玻璃噴霧器（6）鉛筆、直尺等。

3、試劑：

（1）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。

（2）溶劑系統(tǒng)：

正丁醇：甲酸：水=15：3：2（體積比）搖勻；

（3）0.25%的水合茚三酮溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、樣品的準(zhǔn)備：稱取谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各1mg混合溶于10%異丙醇中。

2、濾紙的準(zhǔn)備：取一長方形濾紙，在濾紙縱向?qū)?yīng)的兩邊距邊沿2cm處，各畫兩條平行線，一條作前沿標(biāo)志，一條作點(diǎn)樣線，在點(diǎn)線上每隔2cm畫一個(gè)“+”作為點(diǎn)樣位置，共5個(gè)點(diǎn)。

3、點(diǎn)樣：用毛細(xì)管點(diǎn)樣，中間的點(diǎn)混合氨基酸，兩側(cè)點(diǎn)四種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸；每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)5次，每點(diǎn)一次用電吹風(fēng)吹干后再點(diǎn)下次（此時(shí)，用冷風(fēng)吹干，防止氨基酸變性降解），點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑應(yīng)控制在2mm左右，點(diǎn)樣完畢用大頭針將濾紙做成筒形，點(diǎn)樣面向外,注意紙的兩邊不要接觸。

4、展層：

向?qū)游龈字屑尤雽游鋈軇?，液層不要超過點(diǎn)樣線，（高約1.5cm，約50－60ml溶劑）將濾紙點(diǎn)樣點(diǎn)朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達(dá)標(biāo)志線后取出，冷風(fēng)吹干。

5、顯色：

用噴霧器將0.25％茚三酮顯色劑均勻噴在濾紙上，熱風(fēng)（加快反應(yīng)）反應(yīng)吹干顯色。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算：1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點(diǎn)描出來；

2、測量原點(diǎn)至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計(jì)算各種氨基酸色譜的Rf值。

3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。六、注意事項(xiàng)1.為了防止濾紙被手上的汗液污染，應(yīng)盡量在操作時(shí)帶手套。2.重復(fù)點(diǎn)樣時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)吹干樣品，噴了茚三酮后的顯色則要用熱風(fēng)吹干濾紙。七、思考題1、如何用紙層析法對氨基酸進(jìn)行定性和定量的測定？2、紙層析和柱層析、薄層層析、高效液相層析各有什么特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、加深理解所學(xué)有關(guān)的蛋白質(zhì)性質(zhì)的理論知識(shí)2、掌握氨基酸和蛋白質(zhì)常用的定性、定量分析的方法及原理一、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)是指蛋白質(zhì)所含的某些氨基酸及其特殊結(jié)構(gòu)，在一定條件下可與某些試劑發(fā)生了生成有色物質(zhì)的反應(yīng)。（一）雙縮脲反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一個(gè)顏色反應(yīng)。一般分子中含有兩個(gè)氨基甲酪基(即肽鍵：-CO-NH-)的化合物與堿性銅溶液作用，形成紫色或藍(lán)紫色復(fù)合物，利用這個(gè)反應(yīng)借助分光光度計(jì)可以測定蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲試劑有NaOH和CuSO4配制而成，必須當(dāng)場配制當(dāng)場使用。2、試劑蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清用蒸餾水稀釋10倍，通過2-3層紗布濾去不溶物）0.1%的甘氨酸溶液0.01%精氨酸溶液10%NaOH溶液1%CuSO4溶液3、實(shí)驗(yàn)操作觀察現(xiàn)象取試管4支，按照下表加入各種試劑，觀察現(xiàn)象試劑管號(hào)1234蛋白質(zhì)樣（ml）1.00.01%精氨酸（ml）1.00.1%甘氨酸（ml）1.010%NaOH（ml）2.02.02.02.0蒸餾水（ml）1.01%硫酸銅溶液(滴)4.04.04.04.0現(xiàn)象（二）茚三酮反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)原理在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍(lán)紫色縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)和α—氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物),含有氨基的其他化合物亦可發(fā)生此反應(yīng)。2、試劑蛋白質(zhì)樣液（與雙縮脲反應(yīng)相同）0.1%的甘氨酸溶液0.2%茚三酮溶液3、實(shí)驗(yàn)方法取試管2支，分別加入蛋白質(zhì)樣液及0．1％甘氨酸溶液1ml，然后各加入茚三酮溶液0.5ml，混勻后于沸水浴中加熱數(shù)分鐘，觀察現(xiàn)象。二、蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)是親水膠體，當(dāng)其穩(wěn)定因素被破壞或與某些試劑結(jié)合成不溶性鹽類后，即自溶液中沉淀析出，此現(xiàn)象叫蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用1、實(shí)驗(yàn)原理鹽析現(xiàn)象是指—般蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性鹽至一定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)即自溶液中沉淀析出。鹽析作用與兩種因素有關(guān)：①蛋白質(zhì)分子被濃鹽脫水；②分子所帶電荷被中和。鹽溶現(xiàn)象為低鹽濃度可使蛋白質(zhì)的溶解度增加，實(shí)驗(yàn)時(shí)要加足夠量的鹽。蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程，用鹽析方法沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，較少引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析或用水稀釋時(shí)又可溶解。2、試劑.雞蛋清的氯化鈉溶液（一分雞蛋清加10份0.9%氯化鈉溶液）固體硫酸銨3、實(shí)驗(yàn)操作取雞蛋清氯化鈉溶液約2ml于試管中，加入硫酸銨粉末，注意不要加到壁上，至硫酸銨飽和不再溶解為止，邊加邊振搖，此時(shí)溶液顏色為乳白色，說明原因。（二）重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)1、實(shí)驗(yàn)原理溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以上時(shí)，重金屬鹽類(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)通常比較完全，故常用重金屬鹽除去液體中的蛋白質(zhì)。但應(yīng)注意，在使用某些重金屬鹽(如硫酸銅或醋酸鉛)沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，不可過量，否則將引起沉淀再溶解。此時(shí)的溶解為生成憎水膠體的緣故。試劑蛋白質(zhì)樣液（與雙縮脲反應(yīng)相同）5%CuSO4溶液3%AgNO33、實(shí)驗(yàn)操作取試管2支各加蛋白質(zhì)溶液1ml，向各管分別滴加2-3滴加5％CuS04溶液、3％AgNO3溶液，觀察各管所生成的沉淀。說明原因。（三）有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)1、實(shí)驗(yàn)原理生物堿是植物中具有顯著生理作用的—類含氮的堿性物質(zhì)。凡能使生物堿沉淀，或能與生物堿作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)，稱為生物堿試劑。如鞣酸、苦味酸和磷鎢酸等。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH值低于其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結(jié)合成性鹽而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有機(jī)酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最為靈敏而且特異，因此廣泛的被用于沉淀蛋白質(zhì)，為首選沉淀劑，只能沉淀蛋白質(zhì)，不能沉淀其水解產(chǎn)物，加熱可除去。2、試劑蛋白質(zhì)樣液（與雙縮脲反應(yīng)相同）10%三氯醋酸溶液20%5-磺基水楊酸溶液3、實(shí)驗(yàn)操作（1）取蛋白質(zhì)溶液1ml于試管中，加數(shù)滴三氯醋酸溶液，觀察現(xiàn)象并說明原因。（2）取蛋白質(zhì)溶液1ml于試管中，加數(shù)滴水楊磺酸溶液，觀察現(xiàn)象并說明原因。實(shí)驗(yàn)三、糖的性質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證和鞏固糖類物質(zhì)的主要化學(xué)性質(zhì)。熟悉糖類物質(zhì)的某些鑒定方法。二、儀器與藥品恒溫水浴鍋；5%葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉液；間苯二酚；Benedict試劑（配方：①400mL水中加85g檸檬酸鈉和50g無水碳酸鈉；②50mL加熱的水中加入8.5g無水硫酸銅。制成CuSO4溶液；③把CuSO4溶液倒入檸檬酸鈉溶液-Na2CO3中，邊加邊攪，如產(chǎn)生沉淀可濾去。）；Fehling試劑（甲液氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1g/mL的溶液。乙液硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05g/mL的溶液。使用時(shí)，將4～5滴乙液滴入2mL甲液中，混合后立即使用。）；濃鹽酸、10%NaOH；I2-KI（碘1g+碘化鉀2g+蒸餾水300ml或95%乙醇300ml）、三、實(shí)驗(yàn)步驟1、間苯二酚試驗(yàn)在試管中加入間苯二酚2ml，加入5%葡萄糖溶液1ml，混勻，沸水浴中加熱1-2min，觀察顏色有何變化？加熱20min后，再觀察，并解釋。試樣：5%葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖2、Benedict試劑、Fehling試劑檢出還原糖（1）與Benedict試劑反應(yīng)：取6支試管分別加入1mlBenedict試劑，微熱至沸，分別加入5%葡萄糖溶液，在沸水中加熱2-3min，放冷觀察現(xiàn)象。試樣：5%葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉（2）與Fehling試劑反應(yīng)：取6支潔凈的試管分別加入1.5mlFehling試劑，分別加入0.5ml5%葡萄糖溶液，在60-800C熱水浴中加熱，觀察并比較結(jié)果，解釋為什么？試樣：5%葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉液、濾紙漿3、糖類物質(zhì)的水解（1）蔗糖的水解：取1支試管加入8ml5%蔗糖并滴加2滴濃鹽酸，煮沸3-5min，冷卻后，用10%NaOH中和，用此水解液作Benedict試驗(yàn)。（2）淀粉水解和碘試驗(yàn)①2%淀粉溶液的配制。②碘試驗(yàn)：向1ml淀粉溶液中加入9ml水，充分混和，向此稀溶液中加入2滴碘-碘化鉀溶液，將其溶液稀釋，至藍(lán)色液很淺，加熱，結(jié)果如何？放冷后，藍(lán)色是否再現(xiàn)，試解釋之。③淀粉用酸水解：在100ml小燒杯中，加30ml膠淀粉液，加入4-5滴濃鹽酸，水浴加熱，每隔5min從小燒杯中取少量液體做碘試驗(yàn)，直至不發(fā)生碘反應(yīng)為止，先用10%NaOH中和，再用Fehling試劑試驗(yàn)，觀察，并解釋之。④淀粉用酶水解：在一潔凈的100ml三角燒瓶中，加入30ml膠淀粉，加入1-2ml唾液充分混合，在38-400C水浴加熱10min，將其水溶液用Benedict試劑檢驗(yàn)，有何現(xiàn)象？并解釋。實(shí)驗(yàn)四、酪蛋白的制備一、目的1、學(xué)習(xí)從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。2、掌握等電點(diǎn)沉淀法提取蛋白質(zhì)的方法。二、原理牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。三、材料、試劑與器具（一）材料新鮮牛奶（二）試劑

1、95%乙醇2、無水乙醚3、0.2mol/L

pH4.7醋酸——醋酸鈉緩沖液300ml先配A液與B液A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液

稱NaAC·3H2O

54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)

純醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液3000ml。4、乙醇——乙醚混合液

乙醇：乙醚=1

：1（V/V）

（二）器具

1、離心機(jī)2、精密pH試紙或酸度計(jì)

3、電爐4、燒杯5、溫度計(jì)四、操作步驟（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液100mL，用精密pH試紙或酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000

r

/min）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。

（二）酪蛋白的純化

1、用水洗滌沉淀

3次，離心10分鐘（3

000r/min），棄去上清液。

2、在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合