去負(fù)荷及再負(fù)荷過程pi3kakgsk-3信號(hào)途徑對(duì)骨骼肌蛋白分解及合成代謝的影響

去負(fù)荷及再負(fù)荷過程pi3kakgsk-3信號(hào)途徑對(duì)骨骼肌蛋白分解及合成代謝的影響

隨著人類航天業(yè)的發(fā)展和運(yùn)動(dòng)損傷恢復(fù)的研究，由于負(fù)荷去除，廢用性萎縮越來越受到重視。骨骼肌廢用性萎縮主要由于發(fā)生在肢體固定、疾病、癱瘓等制動(dòng)去負(fù)荷情況下,宇航員在失重條件下癥狀尤其明顯。去負(fù)荷導(dǎo)致的廢用性肌萎縮主要體現(xiàn)在骨骼肌形態(tài)、結(jié)構(gòu)、代謝方面:包括肌肉重量和體積減少,肌纖維直徑(以橫截面積計(jì)算)變小;收縮蛋白,尤其是肌球蛋白重鏈(myosinheavychain,MHC)的表型發(fā)生變化;分解代謝強(qiáng)于合成代謝。針對(duì)去負(fù)荷廢用性肌萎縮而設(shè)計(jì)的恢復(fù)方式有多種,加入運(yùn)動(dòng)負(fù)荷是其中一種重要的方式。本文是以大鼠為研究對(duì)象,研究懸吊去負(fù)荷后,骨骼肌蛋白分解加強(qiáng),發(fā)生廢用性肌萎縮的骨骼肌再以不同方式的再負(fù)荷,探討PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)蛋白表達(dá)的變化,這對(duì)于了解去負(fù)荷廢用性肌萎縮的機(jī)理和選擇對(duì)抗肌萎縮手段具有重要意義。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)備雌性SD大鼠24只,SPF級(jí),8周齡,體重(180~210)g。許可證號(hào):SCXK(京)2002-0001,動(dòng)物編號(hào):0668277(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng),自由飲食。室溫(22±2)℃,相對(duì)濕度50%~70%,12h黑暗與光照交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)北京體育大學(xué)分會(huì)批準(zhǔn)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,按體重隨機(jī)配對(duì)原則分4組:正常對(duì)照組(NC,n=6)、尾部懸吊去負(fù)荷組TS(n=6)、尾部懸吊去負(fù)荷14d+再負(fù)荷自由活動(dòng)14d組NR(n=6)、尾部懸吊去負(fù)荷14d+再負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)14d組ER(n=6)。1.2實(shí)驗(yàn)和指標(biāo)測試1.2.1去負(fù)荷建模及再負(fù)荷方案去負(fù)荷模型:采用廢用性肌萎縮常用的尾部懸吊模型。TS、NR、ER組大鼠尾部懸吊,軀干與平地成25~30°,前肢著地,籠子為航天醫(yī)學(xué)工程研究所特制的模擬失重研究用籠子,動(dòng)物可在內(nèi)自由活動(dòng)和飲食。再負(fù)荷方案:解懸吊后,NR組自由活動(dòng)。ER組離心運(yùn)動(dòng)2周,分兩個(gè)階段:第1周為緩沖適應(yīng)期,第2周為低強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)。緩沖適應(yīng)期:離心運(yùn)動(dòng)組安靜休息3d作為緩沖,第4d適應(yīng)性水平跑15min,跑速為11m/min;第5d下坡跑15min,坡度為5%,跑速為11m/min;第6d下坡跑30min,坡度5%,跑速為11m/min。休息1d后進(jìn)入第2周低強(qiáng)度有氧離心運(yùn)動(dòng)期:每天下坡跑,坡度5%,跑速16m/min,時(shí)間1h。離心訓(xùn)練參照Bedford根據(jù)最大攝氧量對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于58%左右的最大攝氧量水平。1.2.2測試樣本采集與制備2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(45mg/kg)。NC組TS組實(shí)驗(yàn)14d取材,NR和ER組解懸吊按不同再負(fù)荷方式恢復(fù)14d取材,取右側(cè)腓腸肌投入液氮中暫存,取材完成后轉(zhuǎn)移至80℃冰箱。腓腸肌總蛋白含量測定:考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。腓腸肌組織液氮研磨,取200mg腓腸肌研磨成的粉末,以1:5(w/v)比例加入蛋白裂解液RIPA,在冰浴條件下,機(jī)械勻漿離心力為13000g,冰浴20min之后,4℃離心15min,提上清,-804℃保存?zhèn)溆谩IPAbuffer(RadioImmunoPrecipitationAssaybuffer):150mMsodiumchloride,1.0%TritonX-100,1.0%NP-40,1.0%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS(sodiumdodecylsulphate),50MmTrispH8.0,1.0mMEDTA,1.0mMPMSF,1.0mMNaF4℃保存。1.2.3指標(biāo)測試與方法免疫印跡半定量檢測PI3K-p85、Akt、GSK3β和p-GSK3β的蛋白表達(dá)水平:按變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)-濕轉(zhuǎn)-免疫檢測步驟,半定量分析。丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺為29:1,分離膠濃度為10%,堆積膠濃度為4%,電泳儀(瑞典LKB),堆積膠中90V電泳,分離膠150V電泳直至溴酚藍(lán)到電泳槽底部。電泳完畢,將具有目的條帶的凝膠進(jìn)行濕轉(zhuǎn),固相膜為PVDF(Millipore),孔徑4.5μm。4℃封閉及孵育一抗:將載有目的蛋白的PVDF膜在TBST(3%BSA、mMTris-HCl、mMNaCl)緩沖液封閉:β-actin(1:2000,鼠單抗)、β-tubulin(1:1000,鼠單抗)、PI3K(1:500,兔多抗)、Akt(1:2000,鼠單抗)、GSK-3β(1:2000,鼠單抗)、p-GSK-3β(1:2000,兔多抗)(SantaCruz)。一抗4℃過夜孵育后,TBST搖床洗膜3次,每次5min。二抗室溫孵育1h,羊抗小鼠IgG-HRP(1:8000)、羊抗兔IgG-HRP(1:8000),TBST洗膜3次,每次5min。暗室曝光,ECL化學(xué)發(fā)光液孵育印跡膜,柯達(dá)膠片壓片,顯影定影,凝膠系統(tǒng)拍照后ImageJ圖像處理分析蛋白條帶積分光密度。1.2.4數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理收集的數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間的比較用方差分析。2結(jié)果2.1ts組總蛋白含量的變化去負(fù)荷14d后,大鼠腓腸肌的總蛋白含量顯著下降。如表1所示,與NC組相比,TS組總蛋白含量顯著性下降,p<0.05;再負(fù)荷14d,以自由活動(dòng)及低強(qiáng)度有氧離心運(yùn)動(dòng)兩種處理方式進(jìn)行再負(fù)荷比較,NR組及ER組腓腸肌總蛋白含量上升,ER組比NR組含量略高,但兩個(gè)組之間沒有顯著性差異。2.2pi3k蛋白表達(dá)PI3K/Akt白表達(dá)水平的變化去負(fù)荷14d,TS組PI3K-p85蛋白表達(dá)略有升高,PKB略有下降,與NC組相比沒有顯著性差異;在不同條件下再負(fù)荷14d,與NR組相比,ER組PI3K蛋白表達(dá)顯著高于NR組,P<0.05;ER組Akt也高于NR組,但兩組之間沒有顯著性差異。2.3再負(fù)荷對(duì)er組gsk-3蛋白表達(dá)的影響P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達(dá)水平的變化去負(fù)荷14d,P-GSK-3β和βGSK-3β蛋白表達(dá)與對(duì)照組沒有顯著性差異。在不同條件下再負(fù)荷14d,與NC組相比,NR組的P-GSK-3β表達(dá)減少,但沒有顯著性差異;而GSK-3β蛋白增加,也沒有顯著性差異。ER組的P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表達(dá)與NR組的趨勢(shì)相似,其中ER組的P-GSK3β與NC組相比,有顯著性差異,P<0.05;而GSK-3β則顯著增加P<0.05。NR組與ER組之間P-GSK-3β和βGSK-3β蛋白表達(dá)略有差別,但兩者之間沒有顯著性差異。3負(fù)荷抗阻訓(xùn)練去負(fù)荷導(dǎo)致的骨骼肌廢用性萎縮是失重引起的不良影響之一,不僅發(fā)展速度快(5~7d),且嚴(yán)重影響肌肉正常功能。由于去負(fù)荷或微重力作用下,肌肉受載荷刺激減少,肌肉質(zhì)量丟失,肌力下降,收縮特性以及代謝特征都發(fā)生變化。去負(fù)荷的主要結(jié)果使蛋白質(zhì)合成作用減弱,分解作用加強(qiáng)。這可能在懸吊期間,去負(fù)荷或微重力作用激發(fā)了細(xì)胞凋亡信號(hào),從而導(dǎo)致了廢用性肌萎縮有關(guān)。如Parco等2005年研究顯示,大鼠懸吊14d后,腓腸肌濕重明顯減輕,下降30%;腓腸肌濕重/體重比下降11%;凋亡的DNA片段含量增加119%;BaxmRNA增加73%,且Bax和Bcl-2蛋白水平明顯增加,這充分表明,在懸吊期間,去負(fù)荷激發(fā)了與骨骼肌蛋白質(zhì)降解信號(hào),使蛋白質(zhì)分解作用增加而合成代謝作用減弱,同時(shí)伴有肌細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象,導(dǎo)致廢用性肌萎縮的發(fā)生。本研究顯示,懸吊去負(fù)荷14d后,去負(fù)荷組大鼠腓腸肌的總蛋白含量顯著性下降(P<0.05)。對(duì)于失重狀態(tài)下宇航員的研究也證實(shí),去負(fù)荷能使骨骼肌代謝加強(qiáng),肌肉質(zhì)量下降,Trappe等(2009)研究表明,宇航員經(jīng)過6個(gè)月的國際空間站太空飛行,腓腸肌質(zhì)量丟失10%±2%,比目魚肌丟失15%±2%(P<0.05)。去負(fù)荷使肌肉蛋白合成率下降,分解率增加,同時(shí)伴有不同程度的肌細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致骨骼肌發(fā)生費(fèi)用性萎縮。去負(fù)荷使肌肉蛋白合成率下降,分解率增加。通過對(duì)抗廢用性肌萎縮措施,通過抗阻訓(xùn)練誘導(dǎo)骨骼肌纖維產(chǎn)生肥大效應(yīng),激發(fā)骨骼肌蛋白合成信號(hào),增強(qiáng)合成代謝作用,可能有效治療或減慢骨骼肌萎縮。Adams等(2007)通過電刺激方法,結(jié)合等長收縮、向心收縮及離心收縮來防止廢用性肌萎縮。這種復(fù)合式抗阻練習(xí)能有效刺激訓(xùn)練腿一側(cè)的骨骼肌合成代謝增強(qiáng),維持肌肉質(zhì)量及肌纖維含量。經(jīng)過負(fù)荷抗阻訓(xùn)練一側(cè)的肌肉,合成代謝或肌原性標(biāo)志物的總RNA和mRNA數(shù)量增加,翻譯水平提高,如:IGF-1、myoferlin和procollagenIII-α-1;而參與調(diào)節(jié)骨骼肌大小的負(fù)調(diào)節(jié)的myostatin減少。同時(shí),負(fù)荷抗阻模型還能刺激合成代謝信號(hào)活動(dòng)的媒介物的活性,如p70S6激酶。這些研究表明,動(dòng)靜結(jié)合的負(fù)荷抗阻訓(xùn)練能有效刺激合成代謝/生肌調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)抗早期的廢用性萎縮。骨骼肌生長涉及多種不同過程,包括蛋白合成增殖分化、肌衛(wèi)星融合以及肌肉特異性基因表達(dá)。目前在體育科研中研究運(yùn)動(dòng)對(duì)增強(qiáng)骨骼肌蛋白合成率的信號(hào)途徑只要集中在IGF-I/PI3K/Akt/mTOR以及IGF-I/PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)途徑,并且已經(jīng)證明這個(gè)途徑對(duì)維持肌肉體積大小、刺激肌肉肥大及抑制肌肉萎縮方面有重要作用。在研究IGF-I/PI3K/Akt途徑對(duì)骨骼肌纖維生長的作用表明,通過在體電轉(zhuǎn)染組成型活性的Akt-1或Akt-2一周,Akt-1過表達(dá)使轉(zhuǎn)染肌纖維橫截面積增大170%,Akt-2使肌纖維增大100%(P<0.001)。Akt-1或Akt-2的Ser473磷酸化作用增加2.5倍。此外,研究顯示,還可以通過抑制GSK-3β來防止和治療肌萎縮。用IGF-I抑制蛋白降解,至少部分地通過PI3K/Akt介導(dǎo)滅活GSK-3β活性有關(guān)。IGF-I能提高GSK-3磷酸化作用減弱GSK-3β激酶活性。特異性抑制PI3K,也能減弱IGF-I誘導(dǎo)-的GSK-3磷酸化作用。萎縮復(fù)原的骨骼肌中,滅活的GSK-3β與肌核生長以及生肌細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)。這些研究說明,對(duì)抗去負(fù)荷廢用性肌萎縮,可以通過激發(fā)細(xì)胞內(nèi)IGF-I/Akt/mTOR以及IGF-I/Akt/GSK-3β信號(hào)途徑協(xié)調(diào)作用來完成。本研究以14d去負(fù)荷懸吊為模型,以自由活動(dòng)及低強(qiáng)度有氧訓(xùn)練比較對(duì)腓腸肌蛋白合成的影響,假設(shè)低強(qiáng)度有氧訓(xùn)練可能有效促進(jìn)廢用性肌萎縮恢復(fù),增加骨骼肌蛋白合成率。研究結(jié)果顯示,自然再負(fù)荷14d,以自由活動(dòng)及低強(qiáng)度有氧離心運(yùn)動(dòng)兩種處理方式進(jìn)行再負(fù)荷比較,兩種方式都能增加腓腸肌蛋白質(zhì)含量,其中低強(qiáng)度有氧訓(xùn)練組比自由活動(dòng)組總蛋白含量高,但兩組之間沒有顯著性差異。這說明再負(fù)荷的重力作用能刺激腓腸肌的蛋白質(zhì)合成,但低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)的方式比自由活動(dòng)的對(duì)刺激蛋白質(zhì)合成的作用優(yōu)勢(shì)不是十分明顯。此外,在去負(fù)荷條件下,PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β與正常對(duì)照組沒有明顯變化;而在再負(fù)荷條件下,PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β出現(xiàn)明顯變化,其中低強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)組與自由活動(dòng)組相比較,PI3K顯著性增多;Akt也增多,但沒有顯著性差異;P-GSK-3β顯著性減少;GSK-3β顯著性增多,說明GSK-3β活性減弱。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)去負(fù)荷導(dǎo)致的廢用性萎縮模型的腓腸肌進(jìn)行再負(fù)荷恢復(fù)過程中激發(fā)了PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào),腓腸肌蛋白合成增加,這也說明PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)可能參與了骨骼肌蛋白的合成作用。許多研究表明GSK-3β在心肌和骨骼肌生長中作為負(fù)調(diào)節(jié)因子。在萎縮復(fù)原的骨骼肌中,滅活的GSK-3β與肌核生長以及生肌細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)。細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果顯示,IGF-I抑制蛋白降解至少部分地通過PI3K/Akt介導(dǎo)滅活GSK-3β。通過肌原細(xì)胞修飾的小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞C2C12肌原細(xì)胞分化過程研究顯示,缺少GSK-3β蛋白及活性導(dǎo)致加強(qiáng)肌管形成以及骨骼肌特異基因表達(dá)。抑制GSK-3β能恢復(fù)生肌細(xì)胞的分化。在給予IGF-I或LiCl抑制GSK-3活性,能刺激生肌細(xì)胞生長,增加肌管形成,肌酸激酶活性,troponinI促進(jìn)子轉(zhuǎn)活,并且上調(diào)MyoD、Myf-5、Myogenin等的成肌甚至因子的蛋白表達(dá)。此外,研究還證實(shí),在骨骼肌中,胰島素以及運(yùn)動(dòng)都能減少GSK-3β活性。運(yùn)動(dòng)刺激PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)影