響應面法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝

響應面法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝

aif里是中醫(yī)常用的一種藥物。這是薔薇科植物艾（artiemi）的干燥葉子。服藥歷史悠久，如《名醫(yī)》記載。有散寒止痛，溫經(jīng)止血的功效，用于少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)、宮冷不孕、吐血、衄血、崩漏經(jīng)多、妊娠下血；外治皮膚瘙癢。艾葉中含有黃酮類、多糖類化合物，這些化合物具有較強的抗氧化活性?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，植物多糖有增強免疫功能和抗感染的作用，還有治療高膽固醇的作用，且可強化血管和預防動脈硬化、血栓癥、心肌梗塞等。因此，開發(fā)我國的艾葉資源有十分重要的意義。雖然對艾葉的研究很多，但對艾葉多糖的提取工藝研究較少。響應面分析法(responsesurfacemethodology,RSM)是一種優(yōu)化反應條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業(yè)等方面。它與正交試驗設計法不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點。本實驗擬在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法對艾葉多糖提取工藝條件進行優(yōu)化。1材料和方法1.1材料和試劑艾葉產(chǎn)于安徽。優(yōu)質(zhì)工業(yè)酒精、苯酚(AR)、濃硫酸(AR)、蔗糖(AR)。1.2實驗設備及流程AR-1104電子天平奧克斯國際貿(mào)易上海有限公司；DKB-501A型超級恒溫槽上海精宏實驗設備有限公司；SHB-11循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。1.3方法1.3.1多糖含量和提取率的測定1.3.1.標準曲線方程精密稱取l05℃下干燥至恒重的葡萄糖34.00mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分別置于10ml容量瓶中，分別加入蒸餾水補至2ml，然后分別再加入5%苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0ml，搖勻后置40℃水浴中加熱15min，取出置冷水中冷卻10min，同時用2.0ml蒸餾水做空白，用分光光度計在波長480nm處測定吸光度，得標準曲線方程：C=21.834A+1.413，相關系數(shù)R=0.9998。1.3.1.多糖含量的測定多糖含量與提取率的測定：采用苯酚-硫酸法。精密吸取樣品溶液0.5ml于10ml容量瓶中，并加水稀釋定容。然后精密量取1ml于10ml容量瓶中，加蒸餾水補至2ml，然后再加入5%的苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0ml，搖勻后置40℃水浴中加熱15min，取出置冷水中冷卻10min，同時用2.0ml蒸餾水做空白，用分光光度計在波長480nm處測定吸光度。多糖提取率用式(1)計算：式中：比色液濃度單位為μg/ml；比色液體積為8ml；稀釋體積為10ml；定容體積為250ml；供試樣品體積為0.5ml；實驗樣品質(zhì)量為5g左右。1.3.2提取茶多酚的工藝艾葉→干燥→粉碎(過20目篩)→95%濃度乙醇回流→濾渣→蒸餾水回流→抽濾得濾液→定容→測定多糖含量1.3.3試液的制備精確稱取艾葉粉約5.0g置于250ml圓底燒瓶中，加入一定體積的95%乙醇回流1h，過濾，再向濾渣中加入一定量的蒸餾水，在一定溫度下回流一定時間，濾液于250ml容量瓶中定容后取1ml試液定容在100ml容量瓶中。精密移取0.5ml按上述方法測定樣品吸光度，計算多糖含量。2結果與分析2.1單因素試驗2.1.1不同濃度乙醇提取多糖艾葉中含單糖、雙糖、低聚糖、苷類、生物堿、氨基酸及醇溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)，由于多糖溶于水而不溶于高濃度乙醇，根據(jù)此原理先用95%的乙醇回流1h，來除去單糖、低聚糖等對多糖提取率有影響的物質(zhì)，然后用蒸餾水提取多糖。固定95%濃度乙醇在80℃回流1h，提取1次，固定水浸取溫度為80℃，料水比1:16，分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3h，結果見圖1。由圖1可知，隨著加熱時間的延長可以促進多糖的溶解，1h后提取率基本保持不變。但加熱時間若過長，能耗明顯要增加，而且多糖可能要發(fā)生水解，從節(jié)約能源、減少生產(chǎn)周期考慮，提取時間在1h左右為宜。2.1.2提取方法的確定提取時間是影響艾葉多糖提取率的重要因素，且影響成本。固定95%乙醇在80℃下回流1h，提取1次，固定料水比1:16，水浸取時間1h，分別在50、60、70、80、90、99℃下提取，結果見圖2。由圖2可知，隨溫度的升高，多糖提取率不斷增加，到達90℃基本不再增加，趨于平緩，溫度在80、90、99℃無明顯差異，從得到的多糖溶液還發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，多糖色澤加深，考慮到高溫可能對多糖的結構與活性有一定影響，溫度過高多糖易產(chǎn)生降解，而且溫度過高，水分容易揮發(fā)，給操作帶來不便，所以選擇80～99℃作為提取的最佳溫度。2.1.3料水比對水浸提取液用量的影響料水比對提取率具有重要影響，水量多有利于多糖的擴散傳質(zhì)，但水量過多增加蒸發(fā)處理的困難。固定95%乙醇在80℃回流1h，提取1次，固定水浸提溫度80℃、水浸提時間1h，料水比分別取1:8、1:12、1:16、1:20、1:24進行試驗，試驗結果見圖3。由圖3可知，隨著加水量的增大，提取量緩慢增大，但到達1:16時基本達到最大，但加水量到達一定的程度后，提取率基本保持恒定，所以料水比以1:16左右為宜。2.1.4提取溫度和時間的確定提取次數(shù)決定操作成本，操作次數(shù)越多，成本越高，且工藝用水量大。固定95%乙醇在80℃回流1h，提取1次，固定水浸取溫度為80℃，料水比1:16，分別提取4次，結果見圖4。由圖4可知，提取次數(shù)的增多能增加提取總量，在提取一次后，殘渣中多糖含量明顯降低，提取4次已接近于零，但從節(jié)省能耗、減少操作工序以及縮短生產(chǎn)周期考慮，提取次數(shù)取3次為宜。2.2響應面優(yōu)化結果分析根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素影響試驗結果，選取提取溫度、料水比、提取時間對艾葉多糖提取率影響顯著的三個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行試驗設計，分析因素與設計見表1。對提取溫度、提取時間、料水比作如下變換：X1=(T-90)/10,X2=(t-1)/0.5,X3=(z-16)/4，以三次試驗所得多糖提取率的平均值為響應值(Y)，試驗設計與試驗結果見表2(其中15個試驗中，1～12是析因試驗，13～15是中心試驗，用來估計試驗誤差)。采用Statistic6.0軟件處理得響應面分析結果見圖5～7。采用SASRSREG程序?qū)憫蹬c各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程：回歸方程中各變量對指標(響應值)影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率p(F>Fα)的值越小，則相應變量的顯著程度越高。由表3可以看出，各因素中一次項X1、X2、X3是極顯著的，二次項X21、X22、X23也是極顯著的，其次是交互項X2X3、X1X3也是極顯著的，由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。由表3可以看出，回歸方程也是極顯著的，相關系數(shù)R2=0.0825/0.0827=0.9976，說明響應值(提取率)的變化有99.76%來源于所選變量，即提取溫度、提取時間和料水比。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。對回歸方程取一階偏導數(shù)等于零，整理可得如下三式：式(1)、(2)、(3)聯(lián)立方程組，解得X1=0.69,X2=0.425,X3=0.32，代入前述的變換公式得到提取溫度T=96.9℃，料水比Z=1:17.7，提取時間t=1.16h，但考慮到實際操作的便利，將艾葉多糖的最佳提取條件工藝修正為提取溫度97℃，料水比1:18，提取時間1.2h，提取次數(shù)2次。在此修正條件下，實際測得提取率為1.529%，回歸模型預測提取率理論值可達1.544%，實際測定值比理論預測值低0.97%。說明該數(shù)學模型能很好的預測各因素同提取率之間的關系。3艾葉多糖的最佳提取工藝通過單因素試驗設計，以及在