豬群中prrsv、ppv和pcv混合感染的復(fù)合pcr檢測(cè)方法的建立

豬群中prrsv、ppv和pcv混合感染的復(fù)合pcr檢測(cè)方法的建立

豬環(huán)病毒（pcv）是一種單環(huán)流道病毒，約為1.76k。根據(jù)基因組成及抗原性不同，PCV分為兩種血清型PCV1與PCV2，兩者核苷酸序列同源性為68%～75%。PCV1無(wú)致病性，廣泛存在于健康豬群中；PCV2與多種新的豬傳染病的發(fā)生密切相關(guān)，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬呼吸道病復(fù)合征（PRDC）及豬增生性和壞死性肺炎（PNP）等，其中以PMWS的影響最為嚴(yán)重，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病原學(xué)研究表明，PCV-2為PMWS的主要病原，但不是唯一的病原。在PMWS的發(fā)生過(guò)程中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcineparvoductiveandrespiratorydiseasesyndromevirus,PRRSV)及豬細(xì)小病毒（Porcinecircovirus,PPV）可能也起著非常重要的作用。動(dòng)物試驗(yàn)表明，PRRSV或/和PPV與PCV2混合感染會(huì)明顯促進(jìn)PCV2病毒的復(fù)制，從而增強(qiáng)PCV2的致病作用。因此，為了更好地預(yù)防和控制PCV2相關(guān)疾病，我們需對(duì)我國(guó)豬群中PCV2與PRRSV或/和PPV混合感染情況有較清楚的認(rèn)識(shí)，以便制定更有針對(duì)性的防治措施。為此，本研究在系統(tǒng)分析PCV、PRRSV及PPV基因組的基礎(chǔ)上，分別針對(duì)PCV兩種血清型的核苷酸序列、PRRSVORF7基因及PPV的VP2結(jié)構(gòu)基因設(shè)計(jì)合成引物，分別建立了用于檢測(cè)PCV1、PCV2的復(fù)合PCR方法和檢測(cè)PRRSV、PPV的RT-PCR與PCR方法。應(yīng)用復(fù)合PCR方法先對(duì)127份病料進(jìn)行PCV的檢測(cè)。對(duì)67份結(jié)果為PCV2陽(yáng)性的病料再分別進(jìn)行PRRSV及PPV的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有35份表現(xiàn)為PRRSV陽(yáng)性，11份表現(xiàn)為PPV陽(yáng)性。這幾種檢測(cè)方法的建立為臨床上進(jìn)行PCV2、PRRSV及PPV混合感染的流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)疾病的診斷打下了基礎(chǔ)，同時(shí)亦為更好的預(yù)防和控制PCV2相關(guān)疾病提供了科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1臨床材料及試劑PCV2陽(yáng)性毒株、PRRSV陽(yáng)性毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；PPV陽(yáng)性毒株由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。送檢病料：來(lái)源于華東地區(qū)上海、江蘇、浙江及山東等四省市豬場(chǎng)的127份臨床病料，病料采集于臨床表現(xiàn)為呼吸困難，體溫升高及消瘦的患病斷奶仔豬及表現(xiàn)為呼吸困難和繁殖障礙的母豬。取樣前置-80℃凍存。蛋白酶K,RNasin,PCR試劑均購(gòu)自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、Trizol為Promega公司產(chǎn)品；PCR儀為AmpGene公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工；其他常規(guī)試劑均為分析純。1.2pcv1和prrsv引物PCV引物：在參考GenBank中公開(kāi)發(fā)表的PCV1與PCV2基因組核苷酸序列的基礎(chǔ)上，合成以下三條引物。其中引物1,2用于擴(kuò)增PCV1的基因片段，跨幅為652bp。引物1,3用于特異擴(kuò)增PCV2基因片段，長(zhǎng)度為1154bp。PRRSV引物：在參考美洲代表株VL2332ORF7的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了以下2條引物，片段跨幅為整個(gè)ORF7，長(zhǎng)372bp。引物序列如下：PPV引物：參考PPV基因組主要中和抗原基因VP2中的一段，設(shè)計(jì)合成了以下2條引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)848bp，引物序列如下：以上引物均由TaKaRa公司合成。1.3t保苯酚法將病豬的肺、脾、淋巴結(jié)等組織充分研磨，-20℃凍融3次，4℃12000r/min離心10min，取500μL細(xì)胞懸浮液，加入蛋白酶K至終濃度500μg/mL,SDS至終濃度1%，充分混勻后，置55℃水浴作用30min。然后分別用Tris飽和苯酚（pH8.0）、苯酚：氯仿（1∶1）及氯仿各抽提一次，吸取水相，加1/10體積3mol/LNaAc及2.5倍體積無(wú)水乙醇沉淀，-20℃放置2h以上。12000r/min離心15min，沉淀用75%乙醇洗滌，烘干后懸浮于20μL滅菌超純水中。1.4pcr擴(kuò)增鑒定復(fù)合PCR體系：引物濃度為20pmol/μL,dNTPs每種濃度為2.5mmol/L,MgCl2濃度為25mmol/L,rTaq酶為5U/μL，整個(gè)PCR體系為50μL。反應(yīng)成分如下：10×PCRbuffer5μL,dNTPs4μL,MgCl23μL，三個(gè)引物各1μL，模板DNA10Μl,rTaq酶0.5μL，加超純水至50μL，混合均勻，將混合物95℃變性10min后，進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃1min,53℃1min,72℃1.5min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳鑒定以出現(xiàn)1154bp條帶的為PCV2陽(yáng)性，652bp的為PCV1陽(yáng)性，如同時(shí)出現(xiàn)上述兩條帶則表示PCV1與PCV2均為陽(yáng)性。PCR體系：組成為：10×PCRbuffer5μL,dNTPs(2.5mmol/L)4μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,2條PPV引物各1μL，模板DNA10μL,rTaq酶0.5μL(5U/μL），加滅菌超純水至50μL，混合均勻，將混合物95℃變性5min后，進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳鑒定，以出現(xiàn)848bp特異條帶的樣品為陽(yáng)性。1.5pcr檢測(cè)parsv陽(yáng)性毒株的制備取按步驟1.4制備的500μL組織病料懸浮液上清，加入700μLTrizol混勻，室溫放置10min；加入200μL氯仿，混勻，12000r/min4℃離心10min；吸取水相，再用等體積氯仿抽提一次；將水相轉(zhuǎn)移至另一管中，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10min后，12000r/min4℃離心10min；沉淀用75%乙醇洗滌，在超凈臺(tái)中通風(fēng)晾干；RNA沉淀溶解于20μL用DEPC處理過(guò)的滅菌超純水中。同法制備PRRSV陽(yáng)性毒株的RNA模板。RT：總體積為20μL，反應(yīng)體系如下：5×RTbuffer4μL,dNTPs(10mmol/L)2μL,RNasin(40U/μL)1μL,P1,P2各1μL,RNA模板10μL，混勻離心。65℃作用15min，稍冷卻后，加入M-MLV(200U/μL)1μL,42℃1h。95℃作用5min，冷卻后即可進(jìn)行PCR。PCR:PCR反應(yīng)總體積為50μL，包括：10×PCRbuffer5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,RT產(chǎn)物10μL,rTaq酶（5U/μL)0.5μL，加超純水至50μL，混勻，將混合物95℃變性5min后進(jìn)入PCR循環(huán)。參數(shù)設(shè)置為94℃1min,51℃1min,72℃1min。進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以出現(xiàn)372bp條帶的樣品為陽(yáng)性。1.7生化測(cè)序及測(cè)序分別隨機(jī)選取復(fù)合PCR、PCR及RT-PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后直接進(jìn)行測(cè)序，此工作由大連Takara公司協(xié)助完成。應(yīng)用DNAstar軟件將所測(cè)序列與GenBank中發(fā)表的PCV、PRRSV及PPV的相應(yīng)片段區(qū)域進(jìn)行同源性分析，進(jìn)一步證實(shí)擴(kuò)增片段的特異性。2結(jié)果2.1pcv2擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)用建立的復(fù)合PCR方法對(duì)來(lái)自華東地區(qū)127份臨床組織病料進(jìn)行PCV檢測(cè)，結(jié)果從67份樣品中擴(kuò)增出PCV2特異條帶，與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果一致。從21份樣品中同時(shí)擴(kuò)增出1154bp和652bp兩條特異條帶，單獨(dú)擴(kuò)增出一條652bp條帶的有7份樣品。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。2.2“典型片段”電泳結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，67份PCV2陽(yáng)性樣品中的35份可擴(kuò)增出372bp的片段，與陽(yáng)性對(duì)照組VL2332株結(jié)果完全相符，部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可見(jiàn)，待檢樣品中PRRSV與PCV2的混合感染率達(dá)52.3%，說(shuō)明在豬群中PRRSV與PCV2的混合感染已經(jīng)非常普遍。2.3床組織病料ppv的檢測(cè)用PCR方法對(duì)67份PCV-2陽(yáng)性的臨床組織病料進(jìn)行了PPV檢測(cè)，結(jié)果從18份待檢樣品中擴(kuò)增出了PPV848bp的特異條帶，與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果一致（圖略）。2.4序列同源性分析為了進(jìn)一步確定PCR反應(yīng)的特異性，各隨機(jī)選取復(fù)合PCR、PCR及RT-PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果顯示，兩個(gè)復(fù)合PCR產(chǎn)物的序列與GenBank中PCV1毒株AF071879與PCV2毒株AF381177相應(yīng)區(qū)域的序列同源性分別可達(dá)97.9%和98.8%。而PCR和RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)毒株的序列同源性均在99%以上，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的特異性。2pmws癥狀及臨床癥狀PCV2是PMWS的主要病原，但可能不是唯一的病原。PMWS很可能是PCV2與PPV、PRRSV及其它一些病原混合感染的結(jié)果。Pallares等（2002）對(duì)369份臨床PMWS病例進(jìn)行病原分析顯示，PRRSV與PCV2混合感染率達(dá)到了51.9%，只感染PCV2的病例僅占1.9%。Pogranichnyy等（2002）對(duì)許多病原與PMWS的相關(guān)性進(jìn)行了分析表明，就單個(gè)病原而言，PCV2與PMWS的發(fā)生相關(guān)性最強(qiáng)，但如果與PRRSV混合感染則PMWS發(fā)生的危險(xiǎn)系數(shù)比單獨(dú)感染PCV2更高。而且實(shí)驗(yàn)還顯示，健康豬群中PCV2的陽(yáng)性率也達(dá)到了62.5%。因此他們認(rèn)為PMWS的發(fā)生過(guò)程中其它病原如PRRSV可能起著非常重要的作用。Choi等對(duì)10個(gè)臨床PMWS病例進(jìn)行PPV檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)同時(shí)感染有PPV病毒。另外許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PPV或PRRSV與PCV2混合感染可產(chǎn)生PMWS癥狀及典型的組織學(xué)病變。Krakowka等應(yīng)用PCV2分離毒株實(shí)驗(yàn)感染未經(jīng)母乳哺育的仔豬或悉生仔豬僅產(chǎn)生輕微的PMWS癥狀，但如將PPV及PCV2共同實(shí)驗(yàn)感染仔豬則可以成功復(fù)制出典型的PMWS癥狀及病變，但如用PPV單獨(dú)感染沒(méi)有任何癥狀和病變。同樣，利用PRRSV與PCV2混合感染仔豬也已成功復(fù)制出PMWS典型臨床癥狀及特征性病變。另外最近研究也表明，PCV2與PRRSV混合感染在豬增生性和壞死性肺炎（PNP）的發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在該項(xiàng)研究中，作者共對(duì)192份PNP樣病損的肺樣品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有164份樣品（85.6%）共同存在PRRSV和PCV2。因此可以認(rèn)為PRRSV或PPV與PCV2的混合感染在PCV2的致病過(guò)程起著重要的作用。至今，國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有PRRSV或PPV與PCV混合感染的報(bào)道，對(duì)豬群中這三種病毒混合感染的情況也很不了解，為此本研究建立了分別用于檢測(cè)PCV、PPV與PRRSV的復(fù)合PCR、PCR及RT-PCR方法。這幾種檢測(cè)方法的建立為臨床上進(jìn)行PCV2、PRRSV及PPV混合感染的流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)疾病的診斷打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也為更好的預(yù)防和控制PCV2及其相關(guān)疾病提供了科學(xué)依據(jù)。應(yīng)用建立的復(fù)合PCR方法對(duì)來(lái)自華東地區(qū)4省市的127份表現(xiàn)呼吸道癥狀的斷奶仔豬和繁殖障礙母豬病料進(jìn)行了PCV的檢測(cè)，然后應(yīng)用建立的PCR及RT-PCR方法對(duì)67份PCV2陽(yáng)性病料進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)比較嚴(yán)重的二重感染，其中PRRSV與PCV2二重混合感染占樣品總數(shù)的52.3%；18份樣品表現(xiàn)為PCV2與PPV二重混合感染，占26.9%。另外，還有一定比例的三重感染，共5個(gè)樣品，占7.5%。由此可見(jiàn)，豬群中PCV2與PRRSV及PPV混合感染比較普遍，其中尤以PCV2與PRRSV最為嚴(yán)重，應(yīng)該針對(duì)此流行現(xiàn)狀采取綜合性的防制措施。P1:5’-C