側(cè)柏葉總黃酮的質(zhì)量控制

側(cè)柏葉總黃酮的質(zhì)量控制

側(cè)柏葉是柏樹科的一種干燥的側(cè)柏葉。其性味苦澀、性寒,具有涼血止血、鎮(zhèn)咳、平喘和殺菌等作用。其中的黃酮類成分被認為是側(cè)柏葉的主要有效成分之一。目前側(cè)柏葉總黃酮提取物在醫(yī)藥品、保健用品和保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用廣泛。最近研究證實,側(cè)柏葉總黃酮具有α-糖苷酶抑制劑作用,是很有前途的Ⅱ型糖尿病降糖新藥。前期試驗對側(cè)柏葉中總黃酮進行提取純化工藝研究,并確定了“側(cè)柏黃酮”的提取工藝。筆者主要對“側(cè)柏黃酮”質(zhì)量標準進行研究,以期為側(cè)柏葉的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1研究的對象側(cè)柏葉,購自長春市宏檢藥材公司。1.1.2主要設(shè)備UV-1701紫外可見分光光度計和SHIMADZU2010高效液相色譜儀,均購自日本島津公司。1.1.3水和水質(zhì)組成槲皮苷對照品,購自中國生物制品檢定所;甲醇為色譜純,購自美國Fisher公司;水為純凈水,購自杭州娃哈哈集團有限公司;穗花杉雙黃酮對照品,自制,面積歸一化法計算其純度為99.64%,批號20080701;其他試劑為分析純,購自北京化工廠。1.2方法1.2.1黃酮的總含量1.2.1.1.對照溶液的制備取槲皮苷對照品,精密稱定,加無水甲醇制成濃度為0.1mg/ml的對照品溶液。1.2.1.2.樣品溶液的制備稱取側(cè)柏葉總黃酮50mg,至50ml量瓶中,加無水甲醇溶解,定溶至刻度,搖勻濾過,取續(xù)濾液即得。1.2.1.3.選擇探測波長槲皮苷對照品溶液經(jīng)顯色后,進行紫外掃描,在200～400nm進行紫外掃描,選擇最佳測定波長。1.2.1.方法的回歸方程①線性關(guān)系的考察。分別吸取不同濃度的槲皮苷對照品溶液,顯色后,在428nm波長處測定吸光度,以吸光度對質(zhì)量濃度進行線性回歸,計算回歸方程。②精密度的考察。取樣品溶液顯色后連續(xù)進行7次測定,記錄吸光度值,以吸光度值計算RSD。③穩(wěn)定性的考察。取樣品溶液顯色后,分別于0、10、20和30min處測定,記錄吸收值,計算其RSD。④重現(xiàn)性考察。對同1批樣品,獨立進行6次測定,計算其RSD。⑤回收率試驗。取已知含量樣品6份,加入對照品適量,計算其平均回收率和RSD。1.2.1.含量測定和測定總氮的測定精密量取對照品溶液及供試品溶液各1ml,分別放入10ml容量瓶中,加入1ml濃度10%的三氯化鋁甲醇溶液,用無水甲醇定容至刻度,搖勻后于428nm波長下測定吸光度,并計算含量。1.2.2測定了綏化山維斯黃酮的含量1.2.2.流動相、柱溫度色譜柱為AgelaC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相為無水甲醇-水(60∶40,V/V);流速為1.0ml/min;檢測波長為330nm;柱溫為30℃;進樣量為10μl。1.2.2.對照品溶液的制備取穗花杉雙黃酮對照品,精密稱定,加無水甲醇制成濃度為0.5mg/ml的對照品溶液,取1ml置10ml容量瓶中加無水甲醇定溶至刻度,得濃度為0.05mg/ml的對照品溶液。1.2.2.供試品溶液制備取40mg側(cè)柏葉總黃酮,置50ml容量瓶中,加無水甲醇適量,超聲處理10min,并用無水甲醇定容至刻度,搖勻,再吸取1ml置10ml容量瓶中,加無水甲醇定溶至刻度,搖勻濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。1.2.2.標準曲線的繪制①專屬性考察。取溶劑甲醇作為陰性對照溶液,在以上條件下,分別進樣穗花杉雙黃酮對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液,進行專屬性試驗。②線性關(guān)系的考察。分別吸取濃度為0.5mg/ml的對照品溶液各2.5、2.0、1.5和1.0ml,分別置10ml量瓶中,加無水甲醇至刻度,依次得到A、B、C和D,從D中吸取5ml至10ml量瓶,加無水甲醇定溶得E,再從E中吸取5ml至10ml量瓶,加無水甲醇定溶得F,吸取上述對照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀測定,記錄色譜圖,測定其峰面積,以峰面積為縱坐標(Y),穗花杉雙黃酮進樣量為橫坐標(X),繪制標準曲線,并計算回歸方程。③重復(fù)性考察。對同1批樣品照供試品制備方法操作,獨立進行6次測定,計算RSD。④精密度的考察。取樣品40mg,按供試品制備方法,分別于0、2、4、8、12、24和48h依法測定,記錄峰面積,計算RSD。⑤回收率試驗。取同1批樣品6份,每份20mg,置50ml容量瓶中,精密加入濃度為1.001mg/ml的穗花杉雙黃酮對照品溶液10ml,按按供試品制備方法操作,得供試品溶液,測定,計算其平均回收率和RSD。1.2.3測量值對3批樣品中總黃酮含量和穗花杉雙黃酮含量進行測定。2結(jié)果與分析2.1黃酮的總含量2.1.1測量波長的選擇計算得在波長428nm為有最大吸收,故選擇該波長進行測定。2.1.2方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性①線性關(guān)系的考察。計算得回歸方程為Y=62.25X+0.0186(R=0.9993)。試驗結(jié)果表明,在0.00208～0.0208mg/ml范圍內(nèi)槲皮苷濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。②精密度的考察。計算得吸光度的RSD為0.85%,表明該法重復(fù)性良好,方法穩(wěn)定、可行。③穩(wěn)定性的考察。計算得吸收值的RSD為0.73%,表明在30min內(nèi),供試品溶液穩(wěn)定性良好。④重現(xiàn)性考察。計算得吸收值的RSD為1.69%,表明方法重現(xiàn)性良好。⑤回收率試驗。計算得平均回收率為98.00%,RSD為1.98%,表明該方法準確可靠,可用于側(cè)柏葉中總黃酮的含量測定。2.1.3測量值由表1可知,3批樣品的總黃酮的平均含量為65.67%。2.2方法的回收率和精密度試驗2.2.1方法學考察。①專屬性考察。圖1～3表明,在此條件下,穗花杉雙黃酮峰分離良好,陰性對照液在相應(yīng)位置無干擾。②線性關(guān)系的考察。計算得回歸方程為:Y=4000000X-16844,R=0.9997。試驗結(jié)果表明,在0.13～1.3μg/ml范圍內(nèi),穗花杉雙黃酮濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。③重復(fù)性考察。計算得RSD為1.37%,表明方法重現(xiàn)性良好。④精密度的考察。計算得RSD為0.44%,表明在48h內(nèi),供試品溶液穩(wěn)定性良好。⑤回收率試驗。計算得平均回收率為99.266%,RSD為1.48%,表明該方法準確可靠,可用于側(cè)柏葉中穗花杉雙黃酮的含量測定。2.2.3含量測定。由表1可知,3批樣品的穗花杉雙黃酮150.967mg/g。3側(cè)柏葉黃酮含量測定中有效點的確定目前側(cè)柏葉黃酮被應(yīng)用于藥品、保健品以及日化