北運(yùn)河濕地中厭氧氨氧化菌和氨氧化古菌的生物多樣性分析

北運(yùn)河濕地中厭氧氨氧化菌和氨氧化古菌的生物多樣性分析

1氮循環(huán)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)目前，人類活動(dòng)對(duì)氮循環(huán)的干擾影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他因素，極大地加速了地球表層環(huán)境的變化。自1911年世界第一個(gè)合成氨廠建成以來，由人類活動(dòng)產(chǎn)生的全球固氮量約占總固氮量的60%。人類活動(dòng)破壞了現(xiàn)有的氮循環(huán)。大量氮積聚在河流和湖泊之間，地下水被污染，氮素被嚴(yán)重污染。中國河流眾多，但總體污染嚴(yán)重。河流濕地包括河流的岸邊帶,河邊、河叉、河口的沼澤區(qū),與河流連接的淺湖和池塘,是生命元素反應(yīng)的活躍地帶.氮循環(huán)過程主要包括植物和微生物同化吸收和貯存、生物硝化反硝化生成含氮?dú)怏w、生物固氮等.傳統(tǒng)氮遷移轉(zhuǎn)化過程中氨只能由氨氧化細(xì)菌(AOB)在氨單加氧酶(AMO)的催化條件下,被氧化為亞硝酸鹽/硝酸鹽.隨著人們對(duì)自然界氮循環(huán)認(rèn)識(shí)的不斷加深,發(fā)現(xiàn)氨的氧化反應(yīng)還可以由氨氧化古菌(AOA)在古菌氨單加氧酶的催化條件下進(jìn)行(K?nnekeetal.,2005).而且發(fā)現(xiàn)氨的氧化不僅在有氧條件下進(jìn)行,還可以在厭氧/缺氧的條件下,由厭氧氨氧化菌以亞硝酸鹽為電子受體進(jìn)行氧化,定義為厭氧氨氧化(Anammox)(Zhuetal.,2008).恢復(fù)正常的氮循環(huán)是控制氮素污染的根本措施.古菌硝化反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)使人們重新認(rèn)識(shí)氨氧化過程這一氮循環(huán)中的限速步驟,而厭氧氨氧化將氨與硝酸鹽直接作用完成封閉的氮循環(huán),而且兩種反應(yīng)過程均可在缺氧條件下進(jìn)行,不消耗水體中的氧.如果古菌硝化和厭氧氨氧化能在氮循環(huán)模式得到部分實(shí)現(xiàn),不僅可以減少N2O排放量,對(duì)于氮循環(huán)失衡造成的其它氮素污染,如水體富營養(yǎng)化、水體缺氧、地下水污染等,也是一種較佳的解決方法.但是目前關(guān)于氨氧化古菌和厭氧氨氧化的研究和報(bào)道,多限于海洋生態(tài)系統(tǒng),在大陸表層,特別是淡水濕地生態(tài)系統(tǒng),還鮮有報(bào)道(Zhuetal.,2010).本研究本著河流生態(tài)修復(fù)的目的和觀點(diǎn),積極探討在河流濕地中是否存在這兩種氮遷移轉(zhuǎn)化過程的新機(jī)制與新型微生物,以期為恢復(fù)河流生態(tài)系統(tǒng)正常的氮循環(huán)提供思路.2試驗(yàn)方法2.1采樣點(diǎn)和沉積物以海河支流北運(yùn)河為研究對(duì)象.在北運(yùn)河沿程共布設(shè)8個(gè)采樣點(diǎn),如圖1所示.采樣點(diǎn)自北運(yùn)河上游位置的順義區(qū)后沙峪鎮(zhèn)開始,沿途經(jīng)過北京、河北最終至天津市武清區(qū),全程超過120km.采樣點(diǎn)主要選取支流匯入點(diǎn)以及典型污染區(qū)域的上下游,基本覆蓋了北運(yùn)河干流的不同污染特點(diǎn)地帶.沉積物主要采取表層沉積物(20cm),冷藏保存(0～4℃)至實(shí)驗(yàn)室后-20℃保存直至DNA提取.2.2理化指標(biāo)、氨氮和硝氮的測定上覆水理化指標(biāo)的測定:溶解氧濃度(DO)用溶解氧儀(YSI550A)現(xiàn)場測定,pH值用pH計(jì)(DELTA320,METTLERTOLEDO)測定,水樣其它指標(biāo)的測定均按照《水和廢水監(jiān)測分析方法》(國家環(huán)境保護(hù)總局,2002)進(jìn)行.沉積物樣品理化指標(biāo)的測定:全氮(TN)、全磷(TP)和有機(jī)質(zhì)的測定均按照《土壤農(nóng)化分析》規(guī)范進(jìn)行(鮑士旦,2000).氨氮和硝氮的濃度用連續(xù)流動(dòng)分析儀(SAN++,荷蘭Skalar公司)測定.2.3浮霉菌屬的pcr擴(kuò)增和生物活性檢測沉積物DNA采用FastDNAspinkitforsoil(Bio101,USA)進(jìn)行樣品的DNA提取.厭氧氨氧化菌擴(kuò)增采用巢式PCR,首先使用引物pla46f(5′-GGATTAGGCATGCAAGTC-3′)和通用引物630r(5′-CAKAAAGGAGGTGATCC-3′)對(duì)浮霉菌屬進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Neefetal.,1998;Juretschkoetal.,1998);第二步以第一步PCR產(chǎn)物作為模板,使用厭氧氨氧化細(xì)菌特異性引物對(duì)Amx368f(5′-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3′)和Amx820r(5′-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3′)進(jìn)行厭氧氨氧化菌16SrRNAPCR擴(kuò)增(Schmidetal.,2000;2003).氨氧化古菌擴(kuò)增參照文獻(xiàn)(Francisetal.,2005).2.4陽性克隆測序及進(jìn)化樹的構(gòu)建使用PromegaAgaroseGelDNA(Promega,Madison,WI)純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化,將PCR回收產(chǎn)物與pGEM-Teasy(Promega,Madison,WI)載體進(jìn)行連接后,轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞,最后進(jìn)行藍(lán)白篩選.陽性克隆的檢驗(yàn)所用引物為T7、SP6,挑取陽性克隆子,用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ分型,挑取菌株進(jìn)行測序(北京Biomed生物科技有限公司).應(yīng)用DNASTAR軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行編輯,去除載體序列后用BLAST在基因庫中搜索相似序列.同時(shí)將該序列與已發(fā)表的相關(guān)細(xì)菌的16SrRNA序列進(jìn)行多重序列對(duì)齊,使用MEGA3.1軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹.獨(dú)立操作單元(OTU)利用DOTUR軟件進(jìn)行劃分.3上覆水上覆水總氮濃度和氨氮濃度的變化北運(yùn)河采樣點(diǎn)上覆水和沉積物的理化性質(zhì)如表1所示.從表1可以看出,上覆水的氨氮濃度和總氮濃度從采樣點(diǎn)1點(diǎn)至8點(diǎn)逐漸降低,硝氮濃度則呈現(xiàn)不規(guī)則變化;沉積物樣品中污染物濃度變化并不明顯.3.1厭氧氨氧化細(xì)菌克隆經(jīng)PCR反應(yīng)后,在采樣點(diǎn)6處得到厭氧氨氧化菌的陽性結(jié)果.6號(hào)采樣點(diǎn)位于河北省香河境內(nèi),岸邊以雜草為主,水面發(fā)黃,河流寬約70～100m.地處農(nóng)村,人口稀少,附近未見工業(yè)建筑.1～5采樣點(diǎn)和7號(hào)采樣點(diǎn)(北京排污河)未得到厭氧氨氧化菌PCR陽性結(jié)果,其可能原因是因?yàn)檫@些點(diǎn)有大量的發(fā)散小點(diǎn)源污水、工業(yè)廢水、污水處理廠出水匯入,其中含有大量的化學(xué)物質(zhì)、重金屬等污染物,可能是抑制厭氧氨氧菌生長的原因.雖然上覆水和底泥沉積物均檢測到氨和亞硝酸鹽的共存,但是同時(shí)發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)濃度偏高,異養(yǎng)菌的優(yōu)勢生長會(huì)限制厭氧氨氧化菌的生長.8號(hào)采樣點(diǎn)地處天津境內(nèi),此處河流為硬質(zhì)護(hù)岸,微生物難以附著及生長,難以形成厭氧氨氧化菌及其他微生物的良好共生群落結(jié)構(gòu).通過表1對(duì)比可以發(fā)現(xiàn),在發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的6號(hào)點(diǎn)水質(zhì)和底泥沉積物污染物水平均較其他采樣點(diǎn)低,說明其在河流氮循環(huán)修復(fù)過程中,正發(fā)揮著積極的作用.不同于6號(hào)點(diǎn),8號(hào)采樣點(diǎn)水質(zhì)變好的原因很可能是稀釋作用的影響.此采樣點(diǎn)位于八孔閘下游,在此處眾多河流交匯,包括龍鳳河、柳河干渠、黃沙河排水干渠、東糧窩引河.以6號(hào)采樣點(diǎn)樣品構(gòu)建厭氧氨氧化菌克隆文庫.實(shí)驗(yàn)共獲得96個(gè)白色克隆,利用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ對(duì)克隆酶切進(jìn)行初選,選取30個(gè)克隆進(jìn)行測序.測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)(見表2),用DOTUR軟件對(duì)所得的每個(gè)克隆的生物多樣性分析比較,得到3個(gè)不同的OTUs(相似性小于97%),生物多樣性比較低.從表1可知,第一個(gè)OTU包括1個(gè)序列NC-ANAMMOXbacteria-6-18,它與Candidatus“Kueneniastuttgartiensis”(最初發(fā)現(xiàn)于厭氧氨氧化滴濾池反應(yīng)器中)最為相似,相似度達(dá)到98%.第二個(gè)OTU中包括11個(gè)序列,其與Candidatus“Brocadiafulgida”(最初發(fā)現(xiàn)于生物反應(yīng)器中)最為相似,相似度達(dá)到95%.第三個(gè)OTU中包括18個(gè)序列,其與Candidatus“Brocadiafulgida”最為相似,相似度為95%.北運(yùn)河作為北京主要的排水河道,接受大量污水的匯入,其所得厭氧氨氧化細(xì)菌克隆與生物反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化細(xì)菌更為接近.以本研究得出的序列和其相關(guān)的環(huán)境樣本,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2).由圖中可以看出,本研究得出的序列與已知的厭氧氨氧化菌具有很好的親緣關(guān)系,但是生物多樣性不高,僅含有2種厭氧氨氧化菌.這一研究結(jié)果與以往研究具有一定的相似性.以往在自然生態(tài)系統(tǒng)或人工生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌,生物多樣性均較低,例如Candidatus“Scalinduabrodae”存在于東非Tanganyika湖(Schubertetal.,2006),Candidatus“Jetteniaasiatica”存在于上向流厭氧反應(yīng)器(Quanetal.,2008).而Schmid等人(2007)還發(fā)現(xiàn)在海洋生態(tài)系統(tǒng)中,所有的厭氧氨氧化菌都屬于Candidatus“Scalindua”屬,進(jìn)一步說明每種厭氧氨氧化菌都有特定的存在環(huán)境,本研究也證實(shí)了此結(jié)論.但是到目前為止,環(huán)境因子與厭氧氨氧化細(xì)菌的分布特征之間的關(guān)系還不是非常清楚.厭氧氨氧化在缺氧海域的普遍存在,表明厭氧氨氧化是引起海洋固氮損失的主要原因.但是在大陸表層,關(guān)于厭氧氨氧化的報(bào)道還很少(Zhuetal.,2010).3.2南果梨酒在不同生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性經(jīng)PCR反應(yīng)后,發(fā)現(xiàn)在6號(hào)采樣點(diǎn)得到氨氧化古菌的陽性結(jié)果.關(guān)于其他點(diǎn),特別是1～5點(diǎn)和7點(diǎn),不存在AOA的可能原因很可能是其中有機(jī)污染物、重金屬的作用所致.目前關(guān)于氨氧化古菌的研究,國際處于探索階段,僅分離出一種ADA(K?nnekeM,2005),其關(guān)鍵生長因子及影響因素、生長速率及共生微生物等,均處于未知狀態(tài).但是可以推測,在6號(hào)采樣點(diǎn)處,AOA能夠與厭氧氨氧化菌形成共生關(guān)系,且共同對(duì)水相和沉積物氮循環(huán)的修復(fù)起著積極作用.實(shí)驗(yàn)共得到96個(gè)白色克隆,利用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ對(duì)克隆進(jìn)行酶切,得到6個(gè)具有不同序列的克隆.對(duì)所得的每個(gè)克隆的生物多樣性分析比較,得到5個(gè)不同的OTUs,見表2.OTU1和OTU2均包括1個(gè)序列,其分別與蔬菜地(中國)和太湖沉積物中發(fā)現(xiàn)的泉古菌最為相似,相似度分別為99%、98%.OTU3同樣包括1個(gè)序列,其與土壤(中國)中發(fā)現(xiàn)的AOA最相似,相似度為98%.OTU4(1個(gè)序列)、OTU5(2個(gè)序列)與農(nóng)田(中國)中發(fā)現(xiàn)的泉古菌最為相似,相似度分別為95%和98%.泉古菌的生物多樣性在海洋沉積物和水相中都有報(bào)道(Francisetal.,2005),但是在淡水河流沉積物中還很少報(bào)道.AOA在土壤、海洋水相和沉積物中也均有分布,且發(fā)現(xiàn)AOA與其生長環(huán)境具有很大的相關(guān)性,水相、土壤樣品很少重疊,本研究也證實(shí)了此結(jié)論.對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣本和水體(watercolumngroup)、土壤/沉積物(soil/sedimentgroup)兩大進(jìn)化分支中的不同AOA進(jìn)行建樹分析(圖3),發(fā)現(xiàn)北運(yùn)河岸邊帶濕地的古菌amoA序列都與土壤/沉積物進(jìn)化分支中的AOA聚為一簇,而與水相中的AOA進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn).本研究在河流岸邊帶濕地中發(fā)現(xiàn)AOA的存在及其生物多樣性,表明其在淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)過程中占有重要地位.但是目前,AOA在不同生態(tài)系統(tǒng)中的生物地球化學(xué)作用還不清楚,還有很多需要廣泛而深入研究的科學(xué)問題,例如①古菌硝化的活性和最大反應(yīng)速率;②AOA和AOB的自然豐度和分布特性;③硝化反應(yīng)在不同催化酶作用下的關(guān)鍵影響因素和過程效應(yīng)等.4城市濕地污染控制與濕地氮循環(huán)研究通過對(duì)典型河流濕地生態(tài)系統(tǒng)中新型氮循環(huán)微生物的鑒定和多樣性研究,證實(shí)在淡水河流濕地生態(tài)系統(tǒng)中存在厭氧氨氧化菌和氨氧化古菌,且呈現(xiàn)不同的分布特性.厭氧氨