新疆花蠶豆根腐病菌的分離、培養(yǎng)和致病性研究

新疆花蠶豆根腐病菌的分離、培養(yǎng)和致病性研究

甘薯是一種廣泛分布于世界各地的蔬菜和豆類。它主要分布在黃淮地區(qū)和黑龍江恢復(fù)區(qū)。隨著人民生活水平的提高,對包括花蕓豆在內(nèi)的豆類食品種類和數(shù)量的需求越來越多。然而,多種病害時常危害花蕓豆的種植,其中根腐病是花蕓豆的重要病害之一,一般可減產(chǎn)10%~20%,重病地可減產(chǎn)40%,甚至絕收。因此,查明花蕓豆根腐病病原,掌握其發(fā)病規(guī)律并制定相應(yīng)的防治措施,對于花蕓豆種植業(yè)健康發(fā)展無疑具有重要意義。近年來,花蕓豆在新疆的種植面積不斷擴大,同時根腐病的發(fā)病率也不斷上升。雖然,已經(jīng)從病原、病原的生物學(xué)特性及藥劑處理多角度嘗試進行了花蕓豆根腐病的初步研究,但新疆相關(guān)花蕓豆根腐病的研究還極少。因此,本研究旨在探索不同條件下花蕓豆根腐病的發(fā)病規(guī)律,為花蕓豆根腐病的防治提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面供試品種為黑河2號,由阿勒泰地區(qū)布爾津縣布爾津鄉(xiāng)種子公司提供。病土、病株采集于布爾津花蕓豆連作5年以上的發(fā)病田。1.2樣品的制備1.2.1培養(yǎng)基pda將采集回來的病株、病土和帶菌種子分別接入普通培養(yǎng)基[馬鈴薯葡萄糖(PDA)]和專選擇性培養(yǎng)基(察氏、胡蘿卜、沒食子、燕麥瓊脂培養(yǎng)基)上。在25~27℃下培養(yǎng),待長出孢子后進行單孢分離、純化培養(yǎng),將長滿菌絲的培養(yǎng)基風干后粉碎、封裝;同時制備空白培養(yǎng)基一份。1.2.2細菌濾液的制備取病原菌-培養(yǎng)基及空白-培養(yǎng)基各20g,加入1000mL無菌水,在恒溫條件下浸提42h,過濾后得到病原原液和空白培養(yǎng)基原液。1.3花制定苗的培養(yǎng)方法土壤進行高溫滅菌,種子、花盆嚴格消毒,花盆直徑150mm,每盆播種10粒,置于25~27℃下恒溫培育幼苗,2d澆1次蒸餾水。病原濾液濃度在10×10倍顯微鏡下,每視野8~10個孢子,于花蕓豆播種的當天、第6d和第10d各接1次,每盆20mL,重復(fù)3次,以空白培養(yǎng)基為對照。第20d用水將盆土充分浸泡,將土坨輕輕倒出,用流水慢慢沖洗附泥,檢測根部發(fā)病情況。1.4室內(nèi)生物學(xué)特性試驗1.4.1預(yù)處理4.5溫度試驗:溫度梯度為5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,光照時間0h,通氣條件為棉塞封口;pH值為7。光長試驗:光照時間為8h,12h,16h,溫度為20℃,通氣條件為棉塞封口,pH7。通氣條件試驗:通氣條件為膠塞封口、棉塞封口、紗布封口,光照時間0h,pH7。酸堿度試驗:pH值梯度為3,4,5,6,7,8,光照時間0h,溫度為20℃,通氣條件為棉塞封口。將浸有病原濾液的濾紙圓餅(直徑6mm)接入PDA培養(yǎng)基上,蒸餾水為對照,重復(fù)3次。分別于48h,72h,96h測量菌落生長半徑。1.4.2試驗條件及試驗結(jié)果溫度梯度為10℃,15℃,20℃,25℃;土壤含水量梯度為4%,8%,12%,16%,20%;pH梯度為4.0,5.0,6.0,7.0,8.0;容重梯度為1.0,1.1,1.2,1.3,1.5。試驗除溫度試驗外均在15℃恒溫下進行,光照條件均為12h,花盆為150mm,每盆病土重500g,播種10粒,3次重復(fù)。2d補蒸餾水1次,第20d洗根,檢測發(fā)病情況。1.5內(nèi)部防御試驗1.5.1d/l模型材料的制備選取7種殺菌劑:50%多菌靈、70%甲基托布津、50%福美雙、70%甲霜靈錳鋅、50%拌種雙、50%五氯硝基苯、50%甲基立枯靈的可濕性粉劑,加入蒸餾水配制成1000,2000,4000mg/kg溶液。每一溶液吸10mL藥液均勻平鋪于75mmPDA培養(yǎng)基上,無菌水為對照。將制備好的4種病原濾液按1∶1的比例混合,把沾有病原濾液混合液的濾紙圓餅(直徑6mm)接入鋪有藥液的培養(yǎng)基上,每皿3個,重復(fù)3次,空白濾液為對照。于24~26℃恒溫培養(yǎng),14d測量病原的生長直徑。1.5.2不同溫度對盆菌土壤溫度的影響見表17種殺菌劑(同上)分別處理種子,藥劑量為種子重量的0.2%。每盆菌土500g,播種10粒,清水處理為對照,重復(fù)3次。分別置于15℃下恒溫培養(yǎng),2d補滅菌水1次。第18d洗根調(diào)查發(fā)病情況。1.5.3播深410的強制播種子處理同上,小區(qū)面積9m×9m。于4月10日,4月20日2次播種,播深5cm,播量140g/m2,3行為一個處理,各處理隨機排列,重復(fù)3次。待花蕓豆幼苗出土后,調(diào)查出苗數(shù),以后結(jié)合間、定苗,每10d抽取20株苗調(diào)查病情指數(shù)。2結(jié)果與分析2.1室內(nèi)病原體的生物學(xué)特性測試2.1.1芽孢桿菌屬heterwelling、立枯絲核菌f.oxsporum、木刑法經(jīng)不同培養(yǎng)基分離純化,共獲得4個真菌分離株,根據(jù)病原形態(tài)和回接植株的發(fā)病癥狀,初步鑒定為:終極腐霉菌(Pythiumultimum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、木賊鐮刀菌(F.equseti)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani),并分離出孢囊線蟲(Heteroderaglycines)。經(jīng)人工接菌后觀察致病情況,于20d后洗根鑒定結(jié)果顯示,4種病菌對花蕓豆均具致病性,孢囊線蟲可以制造許多傷口,有利于腐生菌的侵入。2.1.2不同立地條件下木剽刀菌的生長情況引起花蕓豆根腐病的4種病原菌對花蕓豆幼苗的致病力是有差別的。調(diào)查發(fā)現(xiàn),經(jīng)單一病原接種,以終極腐霉發(fā)病最強,其次為立枯絲核菌,木賊鐮刀菌的致病力最弱。尤其表現(xiàn)在幼苗的成活率和病情指數(shù)上,終極腐霉菌的差異十分明顯,存活率低于對照9.00個百分點(表1);病情指數(shù)高于木賊鐮刀菌24.59個百分點。苗高和側(cè)根數(shù)也具有相同的趨勢(病情指數(shù)分級標準,0級:地下莖和根無病;1級:地下莖和根有零星病斑,但不連片,須根上無病斑;2級:地下莖和根有較多病斑,病斑面積占莖和根總面積的1/4以下,須根略微發(fā)病;3級:地下莖和根有多數(shù)病斑,病斑面積占莖和根總面積的1/4以上,但不足1/2,幼苗生長受阻,須根減少;4級:地下莖和根病斑面積占莖和根總面積的1/2以上,須根病斑連片,部分須根脫落;5級:地下莖和根布滿病斑,須根全部脫落,主根變黑、縊縮)。2.1.3不同通氣條件對病原菌生長的影響溫度是影響病原菌生長的重要因子之一。在中低溫區(qū),不同溫度下菌落生長速度的對比試驗結(jié)果表明,隨著溫度的升高幾種病原菌生長速度均呈現(xiàn)出加快的趨勢,但在整個試驗溫度區(qū)間內(nèi)尖孢鐮刀菌生長速度最為緩慢。病原菌起始生長的溫度差異顯著,5℃低溫下只有木賊鐮刀菌和終極腐霉菌能緩慢生長;10℃時木賊鐮刀菌和終極腐霉菌生長速度較快。光照時間不同病原菌的生長速度反應(yīng)也不同。木賊鐮刀菌和終極腐霉菌對光照時間較敏感,隨著光照時間的延長,生長速度逐漸下降;尖孢鐮刀菌則不受光照時間變化的影響。封口材料不同造成通氣條件的差異,試驗結(jié)果顯示,通氣條件對病原菌生長的影響差異不明顯,尤其是終極腐霉菌和立枯絲核菌在各種條件下均能迅速生長。隨著pH的增加病原菌生長的速度逐漸加快,但pH大于7以后又有減小的趨勢。中性偏酸均有利于病原菌的生長。其中,尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和終極腐霉菌在pH為3時均不生長,立枯絲核菌的pH適應(yīng)范圍較寬,在pH為3和8時仍能生長得很好;尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和終極腐霉菌對pH均比較敏感,在pH中性偏堿時生長速度明顯下降,具體情況見表2。2.2最佳抑菌效果試驗結(jié)果表明,各種殺菌劑對混合病原致病菌均有不同程度的抑菌作用,并隨著藥劑濃度的增加抑菌效果逐漸增強。其中,抑菌效果最好的是多菌靈可濕性粉劑,菌群生長幾乎完全被抑制,菌落擴展直徑最小;其次是甲基立枯靈和福美霜,菌群凈生長量也受到了明顯的抑制,藥劑濃度最高為400mg/kg時,相對抑菌率分別為93.4%和85.0%;抑制效果最差的是甲霜靈錳鋅,其藥劑濃度為400mg/kg時,相對抑菌率只有62.5%(表3)。2.3家庭游泳池測試2.3.1花制定病趨勢根腐病的發(fā)生與土壤濕度關(guān)系密切,土壤含水量為4%時,種子吸水膨脹困難,發(fā)病率較低。土壤含水量為8%時,植株發(fā)病明顯加重,根部表皮傷口較多。土壤含水量大于16%時,植株發(fā)病率有增大趨勢。試驗結(jié)果顯示,花蕓豆根腐病的發(fā)生與土壤含水量關(guān)系密切,土壤含水量過大或過小均不利于幼苗生長,植株弱小抗病力差,易受病菌侵染而發(fā)病,從而使病情加重。土壤含水量適宜,根腐病發(fā)生就較輕。土壤酸堿度與花蕓豆根腐病的發(fā)生關(guān)系非常密切,土壤酸性程度越高越有利于根腐病的發(fā)生,中性偏酸有利于植株生長,發(fā)病較輕。土壤容重的試驗結(jié)果顯示,隨著土壤容重的增加,花蕓豆根腐病的發(fā)病程度逐漸加重。土壤越疏松越有利于花蕓豆幼根生長發(fā)育,根腐病發(fā)病較輕,土壤過于緊實黏重,根系生長緩慢,不發(fā)達,易受到損傷,有利于病菌侵入,植株發(fā)病較重(表4)。2.3.2根腐病的防治藥劑防效試驗結(jié)果與室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果大致相同,但拌種雙在低溫且水分充足的條件下,對花蕓豆根部有輕度藥害現(xiàn)象。對根腐病的抑制作用從病情指數(shù)上看,防病效果最顯著的是多菌靈,較對照低30.8個百分點,其次是甲基托布津和福美雙,只有拌種雙高于對照2.4個百分點。各處理的出苗率均明顯高于對照,以甲基托布津、福美雙處理的種子出苗率最高,分別高于對照21.7和16.1個百分點;其次是甲基立枯靈和多菌靈。根長和株高情況均好于對照(表5)。2.3.3保苗、保苗和防效分期播種的花蕓豆出苗情況顯示,早播田以福美雙保苗效果最好,高于對照16.3個百分點,甲基立枯靈最差比對照少0.6個百分點,其余各處理均有不同程度的保苗效果。適播田出苗率普遍高于早播田,保苗效果以福美雙最好,高于對照9.7個百分點,其次是五氯硝基苯和多菌靈,也顯著好于對照。各處理的保苗幅度略低于早播田,早播對防效影響比較大的是甲基托布津和五氯硝基苯。防效比較穩(wěn)定的藥劑是福美雙、五氯硝基苯和多菌靈,在各種條件下均有保持較高程度的防病效果(表6)。病情指數(shù)也表現(xiàn)出相似的趨勢,值得注意的是甲基立枯靈對花蕓豆根系的伸長有不同程度的抑制作用,拌種雙的藥害現(xiàn)象在田間表現(xiàn)不明顯。3不同藥劑處理對新疆花東南角的影響通過病原分離、鑒定,初步確定引起新疆花蕓豆根腐病的病原主要由終極腐霉菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、孢囊線蟲等多種病原菌侵染所致。其中,致病力以終極腐霉菌、立枯絲核菌較強,其他幾種病原菌較弱。經(jīng)過對致病菌生物學(xué)特性的測定,發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致新疆花蕓豆根腐病的各種主要病原菌,其生物學(xué)特性差異顯著。終極腐霉菌和木賊鐮刀菌較耐低溫,5℃即可生長,尖孢鐮刀菌生長發(fā)育要求較高溫度,15℃生長速度仍較為緩慢。木賊鐮刀菌和終極腐霉菌受光照時間影響較大,喜歡黑暗的條件。通氣條件對病原菌影響不大,厭氧狀態(tài)大多數(shù)病原菌仍能正常生長。中性偏酸的環(huán)境有利于病原菌的生長,立枯絲核菌的適宜生長范圍更寬一些。由此來看,早春低溫的環(huán)境條件下,植株生長發(fā)育速度較慢,而終極腐霉菌、木賊鐮刀菌和立枯絲核菌等在土壤中卻能正常生長、侵染和發(fā)病,從而導(dǎo)致新疆花蕓豆根腐病常常在