不同加工條件下桑葉中-氨基丁酸的測定

不同加工條件下桑葉中-氨基丁酸的測定

氨基丙烯酸（氨基丙烯酸）是一種廣泛存在于原核生物和真核生物的非物質(zhì)氨基酸。在ph值（4.0310.56）下，它不僅具有正電和負(fù)電，而且具有負(fù)電。它對動(dòng)物、大腦和骨髓也有很多影響。然而，由于gaba作為抑制神經(jīng)血液循環(huán)和轉(zhuǎn)化中樞神經(jīng)系統(tǒng)的手段，它起到了很好的醫(yī)療藥物和保健品的作用。γ-氨基丁酸的快速測定方法很多,但γ-氨基丁酸對電化學(xué)和紫外可見光不靈敏,用直接方法進(jìn)行測定比較困難。目前測定GABA的方法有:放射受體法、薄層掃描法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。放射受體法不夠穩(wěn)定,結(jié)果重復(fù)性較差;薄層掃描法易受環(huán)境因素影響;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法儀器昂貴,樣品的衍生操作復(fù)雜,其應(yīng)用范圍受到一定的限制;高效液相色譜法有一定的優(yōu)勢,但其樣品也要進(jìn)行衍生操作。氨基酸分析儀雖可提供準(zhǔn)確、高靈敏度的測定方法,但常規(guī)的生理體液分析方法耗時(shí)太長(130min),因此不利于大批量樣品的快速分析以及臨床監(jiān)測。因此需要尋找一種簡便、快速、低成本的測定方法。本實(shí)驗(yàn),采用分光光度法測定γ-氨基丁酸的含量,主要依據(jù)是Berthelot反應(yīng)。Berthelot反應(yīng)是利用苯酚和次氯酸鈉與游離氨反應(yīng),生成有色物質(zhì)用來測定不同體系中微量氨及其鹽類,具有極高的靈敏度。ω-氨基酸的反應(yīng)靈敏,而α-氨基酸響應(yīng)低,對于GABA和常規(guī)氨基酸來講,它們在Berthelot反應(yīng)中的響應(yīng)差別懸殊,GABA有很高的響應(yīng)。Tsushida在測定茶葉中谷氨酸脫羧酶活力時(shí),采用比色法測定了酶反應(yīng)體系中GABA含量。然而,植物葉片中含有大量的色素,會(huì)嚴(yán)重干擾比色反應(yīng),這些干擾物質(zhì)很難去除。本實(shí)驗(yàn)對桑葉中水溶性色素的去除和GABA含量的測定方法及GABA熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,以期為桑葉的開發(fā)與利用提供技術(shù)和理論依據(jù),為GABA的相關(guān)研究提供參考。1材料和方法1.1材料表面桑葉(5月):浙大華家池校區(qū)采摘。1.2試劑及儀器苯酚:分析純,杭州雙林化工試劑廠;γ-氨基丁酸:生化試劑,上海伯奧生物科技公司;無水乙醇:分析純,上海申翔化學(xué)試劑有限公司;甲醇:分析純,上海申翔化學(xué)試劑有限公司;無水三氯化鋁:分析純,上海新城精細(xì)化工有限公司;固體氫氧化鉀:分析純,上海申翔化學(xué)試劑有限公司;固體磷酸氫二鈉:分析純,成都東金化學(xué)試劑有限公司;固體磷酸二氫鈉:分析純,成都東金化學(xué)試劑有限公司;次氯酸鈉溶液:分析純,杭州高晶精細(xì)化工有限公司;純凈水:娃哈哈集團(tuán)。1.3儀器、儀器和儀器TDL-60B飛鴿牌離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;SZ101-3型鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱:浙江諸暨電熱儀器廠;ZH-WY-110X恒溫振蕩器:北京瑞利儀器有限公司;UVmini-1240分光光度儀:島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;DK-8D型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;玻璃儀器氣流烘干器:上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;DELTA320pH計(jì):梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;EL204-IC電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1桑葉去色素實(shí)驗(yàn)2.1.1研磨粉碎方法選擇新鮮、基本完整的5~6張桑葉葉片,用蒸餾水將葉片沖洗干凈,100℃烘干1~2h。干燥后的樣品,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎或經(jīng)研磨粉碎。稱取2.5g樣品加入裝有10mL甲醇的離心管中,室溫振蕩10min,5000r/min離心15min,棄上清液,將沉淀全部轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上,待沉淀完全干燥后,將沉淀轉(zhuǎn)移至100mL的燒杯內(nèi),加水25mL,放入恒溫振蕩器中,50℃恒溫振蕩提取2h后,5000r/min離心15min,取上清液定容至25mL,低溫保存?zhèn)溆谩?.1.2吸光度測定水溶性色素一般在260~350nm處具有較強(qiáng)的光吸收,樣品用AlCl3提取后,可消除水溶性色素及雜質(zhì)對測定的干擾,因?yàn)锳lCl3可與水溶性色素結(jié)合形成不溶性絡(luò)合物,經(jīng)離心可去除掉。各取1.0mL樣品提取液,設(shè)置12組,分別加入0、20、40、60、80、100、120、140、150、160、170、180μL2mol/L的AlCl3溶液,為保證體積相同再分別加入180、160、140、120、100、80、60、40、30、20、10、0μL蒸餾水,室溫振蕩15min,放置于高速冷凍離心機(jī)內(nèi)12000r/min離心5min,各取0.5mL上清液,分別加入300μL1mol/LKOH溶液,室溫振蕩5min后,12000r/min離心5min,取上清液,340nm處測定吸光值。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建為研究脫色處理對GABA含量的影響,特選用標(biāo)準(zhǔn)樣品,進(jìn)行脫色處理,同時(shí)選用標(biāo)樣不作脫色處理作為對照。2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品0.025g,用蒸餾水溶解,定容至25mL,配制不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的前面剛配置的GABA標(biāo)液,并加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的蒸餾水,配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,而后,分別加入150μL2mol/L的AlCl3溶液,混勻后室溫振蕩15min,高速冷凍離心機(jī)12000r/min離心5min,取上清液0.5mL于離心管中,加入300μL1mol/L的KOH溶液,室溫振蕩5min,12000r/min離心5min。然后,分別取上清液300μL入小試管中,加0.2mol/LpH10.0的磷酸鹽緩沖液200μL,6%的重蒸酚100μL,混勻后再加入0.8mL5%的NaClO溶液,充分混勻。然后,迅速放入沸水浴中加熱10min,立即置冰浴中5min,待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后,加入2.0mL60%酒精,于645nm波長處測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、GABA含量為橫坐標(biāo),繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.2吸光度測定分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的前面剛配置的GABA標(biāo)液,并加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的蒸餾水,配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,再分別取300μL入小試管中,加0.2mol/LpH10.0的磷酸鹽緩沖液200μL、6%的重蒸酚100μL,混勻后再加入0.8mL5%的NaClO溶液,充分混勻。然后迅速放入沸水浴中加熱10min,立即置冰浴中5min,待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后,加入2.0mL60%酒精,于645nm波長處測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、GABA含量為橫坐標(biāo),繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3吸光度測定取2.1.1中配置的樣品提取液1.0mL,脫色處理后,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線配置進(jìn)行操作,于645nm處測吸光值。測得的吸光度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可求出提取液中GABA的含量。2.4溶液溫度對產(chǎn)物濃度的影響采用分光光度法來測定溫度、加熱時(shí)間及pH對GABA穩(wěn)定性的影響。取0.10gGABA標(biāo)品定容至100mL,配成GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照脫色方法進(jìn)行處理,用于穩(wěn)定性的測定。取12個(gè)小試管,分別加入2mL上述GABA標(biāo)液,塞好試管塞,確保液體不會(huì)有滲漏現(xiàn)象產(chǎn)生。將試管外壁擦干后,稱其總質(zhì)量,并作好記錄。本實(shí)驗(yàn)共計(jì)實(shí)驗(yàn)組9組、對照組2組,具體處理如下:(1)調(diào)節(jié)樣品溶液pH到4.5,分別在85、93、100℃3種不同溫度下加熱20min,以測量加熱溫度對γ-氨基丁酸含量的影響;(2)調(diào)節(jié)樣品溶液pH到4.5,分別在93℃溫度下加熱5、15、25min,以測量加熱溫度對γ-氨基丁酸含量的影響;(3)將樣品溶液pH分別調(diào)至4、5、6,在93℃溫度下加熱15min,以測量pH對γ-氨基丁酸含量的影響。3結(jié)果與討論3.1脫除提取液中對色素的干擾如圖1所示,經(jīng)AlCl3處理后,樣品中的吸光度明顯下降,表明AlCl3能顯著降低提取液的光吸收值,有效地去除了提取液中水溶性色素。實(shí)驗(yàn)表明,桑葉樣品未經(jīng)脫色處理,其中的色素會(huì)干擾比色反應(yīng),故應(yīng)去除。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出,1mL的樣品提取液加入150μL的AlCl3溶液,即可有效去除色素。3.2重復(fù)測定根據(jù)比色法測定數(shù)據(jù),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程式為:Y=0.188X+0.0413,R2=0.9973,如圖2所示。重復(fù)測定3次,結(jié)果相接近。由圖2可以看出,經(jīng)過脫色處理的樣品穩(wěn)定性很好,脫色處理對GABA含量的影響比較小。3.3干擾物質(zhì)測定根據(jù)比色法測定數(shù)據(jù),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程式為:Y=0.3184X+0.0264,R2=0.9736,如圖3所示。重復(fù)測定3次,結(jié)果相接近。由圖3可以看出,標(biāo)準(zhǔn)樣品中有少量干擾物質(zhì),影響GABA的含量測定。因此應(yīng)采用脫色方法處理樣品,進(jìn)行桑葉中GABA含量的測定。3.4gaba含量的確定將配置的樣品提取液按上述脫色方法進(jìn)行GABA含量測定。測定得吸光度ABS=0.0833,桑葉中GABA的含量按下式計(jì)算:GABA質(zhì)量比(mg/g)=C×V/m式中:C為由直線方程計(jì)算的值,mg/mL;根據(jù)公式,計(jì)算得出桑葉中含有2.247mg/g的GABA,即100g桑葉中約含有224.7mg的GA-BA。3.5不同溫度對gaba穩(wěn)定性的影響由圖4我們可以看出,溫度較高對GABA的損耗較大。85℃和93℃分別處理20min后,GABA損耗量大致相同,分別是下降了24.5%和27.5%;而100℃溫度下處理20min,GABA相對93℃溫度情況下又減少了一部分,并且減少量相對較大,高達(dá)59.2%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為,在85~100℃之間應(yīng)該有一個(gè)溫度點(diǎn),超過這個(gè)溫度點(diǎn)后,GABA的穩(wěn)定性逐步變差,而處于85~93℃溫度下,GABA的穩(wěn)定性相對較好。因此,在實(shí)際生產(chǎn)加工過程中,可以將溫度設(shè)定在85~93℃之間,以減少溫度造成的GABA含量的損失,盡可能地提高原料中GABA的利用率。3.6加熱時(shí)間對gaba穩(wěn)定性的影響由圖5可以看出,加熱處理的時(shí)間對GABA含量會(huì)產(chǎn)生一定影響。加熱5min,GABA含量即有一定的下降,為23.6%;繼續(xù)加熱到15min,GABA含量的變化下降到26.5%;到25min時(shí),GABA含量再有一定的下降,為35.0%。說明加熱時(shí)間在15min,GABA的穩(wěn)定性較好,而多于15min以后,會(huì)對樣品中GABA產(chǎn)生較大的損耗。在實(shí)際生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量將加熱時(shí)間控制在15min以內(nèi),以保持GABA的穩(wěn)定性。3.7ph對gaba含量的影響由圖6可以看出,不同pH條件下,GABA的穩(wěn)定性有較大的變化,pH對GABA含量的影響逐漸變大,當(dāng)pH為4和5時(shí),GABA含量分別下降25.5%和41.8%,當(dāng)pH為6時(shí),GABA含量有較為顯著的下降,為53.1%。因此在生產(chǎn)過程中,應(yīng)盡量避免這一pH范圍,使樣品中GABA有良好的穩(wěn)定性。4加熱時(shí)間和加熱溫度對樣品穩(wěn)定性的影響實(shí)驗(yàn)中通過AlCl3溶液去除了桑葉中水溶性色素的干擾,去色效果較好,得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想:1mL的樣品提取液加入150μL2mol/L的AlCl3溶液,即可有效去除色素。γ-氨基丁酸穩(wěn)定性的研究中,當(dāng)加熱時(shí)間為20min、