分子克隆(亞克隆)實驗總體流程詳解

一、擴增1、LB培養(yǎng)基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。種類根據細菌抗性決定；3、菌體：看渾濁度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃搖床220轉，過夜，12-16h。二、純化質粒DNA1、1.5ml離心管，編號一定要寫清楚；2、加滿離心管，離心12000xg.1min，棄上清。取三次；3、加BufferS1200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻蓋緊瓶蓋，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能劇烈（以免基因組DNA的污染），上下翻轉4-6次，直至形成透亮的溶液，時間少于5min。目的是使蛋白包裹基因組DNA，游離質粒；5、加S3280ul，溫和充分翻轉混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮狀)；*備注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制備管（置于2ml離心管），12000xg，1min，去濾液；7、加BufferW1500ul，12000xg，1min，棄濾液；8、加BufferW2700ul，12000xg，1min，棄濾液。重復一遍；9、空管離心12000xg，1min；10、制備管移入新的1.5ml離心管，管膜中加60-80ul去離子水，靜置1min，12000xg，1min。（將去離子水加熱至65度，將提高洗脫效率）三、酶切體系EcoRⅠ1ul如需要6管，則先統(tǒng)一配7管的量，再分別加入酶的總量不宜超過總體系的10%，以防星活性的發(fā)生BamHⅠ1ulBufferEcoRⅠ5ul以此定體系，稀釋成1X的就好BSA0.5ul使其終濃度為100ug/ul（1X）去離子水30.5ul定容至BufferEcoRⅠ1X的量Plasmid12ul量要足夠Sum50ul37°兩小時以上即可四、跑膠回收：sost回收失敗1、2%濃度膠，LoadingBuffer如是6X，則加10ul到樣品，全部加樣到膠孔中。插入：配膠方法大塊膠60ml；小塊膠25ml；需要配置大塊膠、大孔膠；Agarose0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁熱但不燙手時加入goldview0.5ul/25ml；倒入槽里。2、跑膠：單位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。3、紫外燈下切膠，紙巾吸進液體，計算凝膠重量（1mg=1ul）；4、加3個凝膠體積的凝膠結合液DB（0.1ul視為100ul；如凝膠濃度大于2%，則加入6倍體積溶膠液；凝膠塊最大不能超過400ul，超過可多個離心柱）；5、56℃水浴放置10分鐘，至完全溶解；6、每100mg最初的凝膠重量加入150ul的異丙醇，震蕩混勻，回收大于4Kb的片段可不加異丙醇，加入反而降低回收效率；7、將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，棄液體；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，棄廢液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，棄廢液；10、空離心2min，棄廢液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反應；12、將吸附柱放入新的1.5ml離心管，加入50ul（最少30ul）洗脫緩沖液EB或者去離子水（65-70水浴加熱效果更好，或將得到的溶液重新加入離心柱可增加洗脫量）；五、連接體系：pLXSNAmp+135pLXSNAmp+S100PNOGDKK對照Insert7ul3ul7ul0ulVector—pLXSN1ul1ul1ul1ulT4連接酶1ul1ul1ul1ulBuffer1ul1ul1ul1ul去離子水0ul4ul0ul7ulpLRES2Kana+246pLRES2Kana+S100PNOGDKK對照Insert7ul3ul7ul0ulVector—pLRES21ul1ul1ul1ulT4連接酶1ul1ul1ul1ulBuffer1ul1ul1ul1ul去離子水0ul4ul0ul7ul16℃過夜六、轉化1、加感受肽：連接產物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震動；3、加500ulLB培養(yǎng)基；4、37℃，150轉搖床，45min；5、鋪板子七、檢測1、細菌長勢良好，對照組不長；2、酶切檢測：（1）1mlLB體系：1mlLB培養(yǎng)基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ulPcr體系：7.5ulMix（2X）5.5ulwater1ul上游引物1ul下游引物（3）用槍頭挑培養(yǎng)皿中的菌體，吹打于1mlLB體系中，再吹打于15ulPcr體系中；（4）1mlLB體系放入37℃搖床，150rpm；（5）15ulPcr調節(jié)：360酶Promega酶步驟溫度℃時間步驟溫度時間1940:02:001950:02:002940:00:302950:00:30360（可調節(jié)）0:00:303600:00:304720:00:454720:00:455GOTO2REP345GOTO2REP346720:10:006720:10:007HOLD4.0°ENTER7HOLD4