第一講基因工程概論及其應(yīng)用

基因工程原理與技術(shù)

本課程的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物工程生物技術(shù)基因克隆

GeneCloningandDNAAnalysis書(shū)號(hào)：7040112035

TerryABrown

2001DepartmentofBiochemistryandAppliedMolecularBiologyUniversityofManchesterInstituteofScienceandTechnology(UMIST)曼徹斯特大學(xué)理工學(xué)院分子生物學(xué)系UK,

wasfoundin

1824Manchester:Internationalmusiccenter,famousfootballclub

基因工程發(fā)展史及應(yīng)用1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物。1982重組人胰島素在英美獲準(zhǔn)使用1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊）中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚(yú)1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程

基因工程發(fā)展史及應(yīng)用19世紀(jì)中孟德?tīng)柾愣闺s交試驗(yàn)遺傳因子經(jīng)典遺傳學(xué)

20世紀(jì)初摩爾根果蠅雜交實(shí)驗(yàn)基因基因?qū)W

1944年艾弗瑞肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)遺傳物質(zhì)DNA1953年沃森-克瑞克DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)

1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶DNA分子體外拼接分子遺傳學(xué)

重組DNA技術(shù)的理論基礎(chǔ)提高外源基因的劑量——分子遺傳學(xué)原理篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等

——分子生物學(xué)原理

修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等

——分子生物學(xué)原理

基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)

——生化工程學(xué)原理

基因工程的基本原理●1967年

世界上5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNALigase

1970Wisconsin大學(xué)H.G.Khorana發(fā)現(xiàn)T4DNALigase●1970年Hopkins大學(xué)H.O.Smith等分離到第一個(gè)限制性內(nèi)切酶(1978NobelPrize

)●1972年

Stanford大學(xué)P.Berg等，DNA體外重組（SV40和λDNA)一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來(lái)，一種新的重組DNA分子產(chǎn)生。●

1973年美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校H.Boyer和Stanford大學(xué)Cohen等完成了真正意義上的DNA體外重組實(shí)驗(yàn).

重組DNA技術(shù)的大事件●

PCR

1985,KaryMullis(1944-)Cetus

KaryB.Mullis,LaJolla,CA,USA

TheNobelPrizeinChemistry1993MichaelSmith(1932-2000)

UniversityofBritishColumbiaVancouver,CanadaTaqpolymerase,

1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來(lái)的

胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體一些已通過(guò)細(xì)菌、真核細(xì)胞或生物體制藥合成的人類蛋白轉(zhuǎn)基因西紅柿一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物藍(lán)色妖姬一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物耐鹽性高的轉(zhuǎn)基因煙草、棉花、水稻轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物水母能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚(yú)普通熱帶斑馬魚(yú)是不發(fā)熒光的如何讓普通熱帶斑馬魚(yú)也發(fā)熒光?家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想基因工程：通俗的說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物(供體）的某種基因提取出來(lái)，與載體在體外進(jìn)行DNA重組，然后放到另一種生物的細(xì)胞（受體）里，定向地改造生物的遺傳性狀。自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無(wú)目的

基因工程有目的一、基因工程概念基因拼接技術(shù)DNA重組技術(shù)分子克隆基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)實(shí)質(zhì)基因重組基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程.一、基因工程概念需要解決什么問(wèn)題？如何獲得目的基因？如何將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞？目的基因的表達(dá)檢測(cè)？基因工程步驟中需要哪些工具？步驟一的工具：步驟二的工具：步驟三的工具：基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶基因的針線——DNA連接酶基因的運(yùn)載工具——運(yùn)載體二、基因操作的工具基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶限制酶二、基因操作的工具DNA的一段序列EcoRI識(shí)別序列

一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列（4-6bP，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子切斷。其它常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基

大腸桿菌的質(zhì)粒：基因的運(yùn)載工具——運(yùn)載體：二、基因操作的工具

常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒

運(yùn)載體必須同時(shí)滿足三個(gè)要求：①能與目的基因結(jié)合；②能進(jìn)入受體生物細(xì)胞并在受體生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；③比較容易得到。作為運(yùn)載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。二、基因操作的工具基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶連接形成磷酸二酯鍵二、基因操作的工具用相同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒目的基因基因的針線──DNA連接酶連接酶的作用是：將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來(lái)，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。重播導(dǎo)入擴(kuò)增四個(gè)基本步驟：1）提取目的基因2）目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測(cè)和表達(dá)三、基因工程基本步驟例：抗蟲(chóng)棉的獲得：關(guān)鍵步驟：提取抗蟲(chóng)基因；與運(yùn)載體的結(jié)合；重組DNA導(dǎo)入棉花細(xì)胞工具：限制性內(nèi)切酶；DNA連接酶；運(yùn)載體三、基因工程基本步驟第一步、目的基因獲得1.化學(xué)合成法2.基因組DNA（鳥(niǎo)槍法）基因組DNA文庫(kù)—存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌中、克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合3.cDNAcDNA文庫(kù)4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR提取目的基因的方法用限制酶切斷成許多片段⑴直接分離基因——鳥(niǎo)槍法

將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。

該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。三種目的基因提取的方法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥(niǎo)槍法反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過(guò)程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。第二步、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合第三步：將目的基因?qū)胧荏w