第十二章 DNA的生物合成-2016

第十二章

DNA的生物合成

(TheBiosynthesisofDNA)生物有機體的遺傳特征以密碼(code)的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序-遺傳信息，在細(xì)胞分裂前通過DNA的復(fù)制(Replication)，將遺傳信息由親代傳遞給子代，在后代個體發(fā)育中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄(Transcription)給RNA，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀，這種遺傳信息的傳遞方向，是從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)，即所謂的生物學(xué)“中心法則”，80年代后在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳信息也可存在于RNA分子中，由RNA通過逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)的方式將遺傳信息傳遞給DNA。1958年，弗朗西斯·克里克提出了“中心法則”。他指出：遺傳信息只能單向傳遞，即從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)。那時的“中心法則”只包括遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中，以及遺傳信息從DNA傳遞給DNA的復(fù)制過程。其圖解如下：DNA→RNA→蛋白質(zhì)中心法則它包含幾個要點：

(1)DNA的功能是轉(zhuǎn)錄，它控制生命的遺傳和生長，而它的基本結(jié)構(gòu)不受生物活動和變化的影響，它是最保守的大分子，忠實地復(fù)制自身，抵制一切變革和進(jìn)化。

(2)進(jìn)化是起因于DNA偶然復(fù)制錯誤。

(3)眾多的偶然復(fù)制錯誤，只有通過天擇才能優(yōu)勝劣汰，使生物不斷地進(jìn)化。

那么遺傳信息真的如克里克指出的只能單向傳遞嗎？

1970年生物學(xué)家梯明和巴爾蒂姆得出了與上述中心法則不同的結(jié)果，他們分別在腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶），在這種酶的催化下，RNA可以指導(dǎo)合成DNA，說明細(xì)胞中遺傳信息可以從RNA傳遞給DNA。另外的一些病毒實驗還表明，RNA是遺傳信息的攜帶者，具有自我復(fù)制的能力，并同時作為mRNA，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的生物合成。中心法則

上述結(jié)果促使克里克在1971年對中心法則作了進(jìn)一步補充與完善。補充后的中心法則如下圖所示:DNA中的堿基排列順序決定了蛋白質(zhì)中的氨基酸的順序，決定了蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)

中心法則表示的是DNA和RNA以及蛋白質(zhì)之間信息流的傳遞順序，也叫做“中心命題”?；竟饺缦拢?/p>

DNA

RNA→蛋白質(zhì)中心法則

我們說DNA決定蛋白質(zhì)，說的就是DNA決定蛋白質(zhì)中的氨基酸排列順序。氨基酸的排列順序定下來，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能也就確定了。所以說，DNA決定蛋白質(zhì)。

瘋牛病，是一種侵犯牛中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性的致命性疾病，由一種非常規(guī)的病毒——朊病毒（Prion）引起的一種亞急性海綿狀腦病，這類病還包括綿羊的癢病、人的克-雅氏?。–reutzfeldt-JakobSyndrome,CJD）（又稱早老癡呆癥）以及最近發(fā)現(xiàn)的致死性家庭性失眠癥等等。

瘋牛病的出現(xiàn)對一致的中心法則提出了挑戰(zhàn)。因為在瘋牛病的朊病毒是一類非正常的病毒，它不含有通常病毒所含有的核酸，而是一種不含核酸僅有蛋白質(zhì)的蛋白感染因子。其主要成分是一種蛋白酶抗性蛋白，對蛋白酶具有抗性。

可能的信息流是：

蛋白質(zhì)→DNA→RNA

由DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的信息流是遺傳信息流，而由蛋白質(zhì)向DNA、RNA的信息流向是反饋信息流，它們是兩種性質(zhì)不同的信息流，前者為了保持不變，是以拷貝、轉(zhuǎn)錄等方式進(jìn)行的，而后者反饋新信息影響DNA局部的改變，是通過傳導(dǎo)、催化、參與、調(diào)控等方式進(jìn)行的；前者是一次性的拷貝和轉(zhuǎn)錄便可實現(xiàn)信息流動的目標(biāo)，形成對象性的蛋白，而后者卻要多代持久的反饋才能由漸變到突變實現(xiàn)進(jìn)化的目標(biāo)。不區(qū)分不同目標(biāo)和方式的信息流，認(rèn)為蛋白質(zhì)只有像DNA一樣能進(jìn)行拷貝，才能出現(xiàn)逆向信息流，就會永遠(yuǎn)陷入中心法則的單向信息流而不得其解。

既然生物三種大分子之間有雙向信息交流，就應(yīng)名副其實地用雙向法則來替代中心法則。由DNA→RNA→蛋白質(zhì)的遺傳信息流，是生物衍演后代保持物種穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄信息流，是非常重要的一個流向；但由蛋白質(zhì)→RNA→DNA，以及由蛋白質(zhì)→DNA→RNA的信息流向，是促使生物不斷開放、進(jìn)化的反饋信息流，是另一必不可少的重要的信息流。正是由于這雙向的信息流，才使生物不斷衍演進(jìn)化，從低級到高級、從簡單到復(fù)雜、從單一到豐富，經(jīng)過38億年發(fā)展為今天這樣無比生機勃勃，豐富多彩、協(xié)同有序的生命世界。第一節(jié)DNA的復(fù)制合成第二節(jié)DNA的反轉(zhuǎn)錄作用第三節(jié)DNA的損傷與修復(fù)第一節(jié)DNA的復(fù)制DNA作為遺傳物質(zhì)的基本特點就是在細(xì)胞分裂前進(jìn)行準(zhǔn)確地自我復(fù)制(self-replication)，使DNA的量成倍增加，這是細(xì)胞分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)。1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型指出，DNA是由二條互補的脫氧核苷酸鏈組成，所以一條DNA鏈上的核苷酸排列順序是由雙螺旋DNA的復(fù)制另一條決定的。這就說明DNA的復(fù)制是由原來存在的分子為模板來合成新的鏈。DNA的合成機理5’5’3’3’復(fù)制的基本規(guī)律（1）半保留復(fù)制（2）在特定的部位開始

原核一個/真核多個（3）單向或雙向（4）從5’3’方向進(jìn)行（5）半不連續(xù)復(fù)制（6）需要RNA作為引物雙螺旋DNA的復(fù)制曾經(jīng)有過多種關(guān)于DNA復(fù)制方式的學(xué)說，包括半保留復(fù)制，全保留復(fù)制以及分散復(fù)制：兩條DNA母鏈用黃色，新合成的DNA鏈用藍(lán)色表示。DNA分子復(fù)制時可能有三種途徑，每一種都遵循堿基互補原則：1.保留復(fù)制途徑認(rèn)為復(fù)制完成后保留最初的母鏈并另外產(chǎn)生一條全新的完整DNA雙鏈分子；2.分散復(fù)制途徑認(rèn)為復(fù)制后產(chǎn)生兩條新老雜合的DNA雙鏈分子，而且每條單鏈上新片段和老片段也是雜合在一起的；3.半保留復(fù)制途徑認(rèn)為復(fù)制后產(chǎn)生兩條新老雜合的DNA雙鏈分子；但是每條DNA雙鏈分子中的單鏈，一條完全是新的，一條完全是老的。事實上，DNA的復(fù)制是半保留的。DNA母鏈中的兩條單鏈各自作為新鏈合成的模板，按照堿基互補原則在母鏈上合成新鏈。合成的每條子鏈DNA雙鏈分子中，各有一條新老單鏈。(一)DNA的半保留復(fù)制(semiconservativereplication)Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時即推測，DNA在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂，兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。一、DNA復(fù)制的方式及一般過程：半保留復(fù)制的證明

1958年Meselson和Stahl利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復(fù)制：DNA的半保留復(fù)制第一代分子含有一條親代的鏈(用黑色素示)，與另一條新合成的鏈(用白色表示)配對。在以后的連續(xù)復(fù)制過程中，原來親代的兩條鏈仍然保持完整，因此總有兩個分子各具有一條原來親代的鏈。Inordertodeterminewhichofthesemodelswastrue,thefollowingexperimentwasperformed:TheoriginalDNAstrandwaslabelledwiththeheavyisotopeofnitrogen,N-15.ThisDNAwasallowedtogothroughoneroundofreplicationwithN-14,andthenthemixturewascentrifugedsothattheheavierDNAwouldformabandlowerinthetube,andtheintermediate(oneN-15strandandoneN-14strand)andlightDNA(allN-14)wouldappearasabandhigherinthetube.Theexpectedresultsforeachmodelwere:

半保留

復(fù)制實驗DNA雙螺旋是由兩條方向相反的單鏈組成，復(fù)制開始時，雙鏈打開，形成一個復(fù)制叉(replicativefork,從打開的起點向一個方向形成)或一個復(fù)制泡(replicativebubble，從打開的起點向兩個方向形成。)兩條單鏈分別做模板。各自合成一條新的DNA鏈。由于DNA一條鏈的走向是5’→3’方向，另一條鏈的走向是3′→5′方向，但生物體內(nèi)DNA聚合酶只能催化DNA從5′→3′的方向合成。那么，兩條方向不同的鏈怎樣才能做模板呢?(二)DNA復(fù)制的一般過程：

原來，在以3’→5’方向的母鏈為模板時，復(fù)制合成出一條5’→3’方向的前導(dǎo)鏈(leadingstrand)，前導(dǎo)鏈的前進(jìn)方向與復(fù)制叉打開方向是一致的，因此前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而另一條母鏈DNA是5’→3’方向，它作為模板時，復(fù)制合成許多條5’→3’方向的短鏈，叫做隨從鏈(laggingstrand)，隨從鏈的前進(jìn)方向是與復(fù)制叉的打開方向相反的。隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazakifragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般100-200核苷酸。最后再將多個崗崎片段連接成一條完整的鏈。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以從總體上看DNA的復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制：DNA的半不連續(xù)復(fù)制

DNA復(fù)制是半保留復(fù)制，即經(jīng)過一輪復(fù)制，在子代雙鏈DNA分子中有一條鏈來自親本的舊鏈，另一條鏈為新合成的。復(fù)制開始時，親代DNA雙鏈分子打開，分別作為模板，連續(xù)地合成一條前導(dǎo)鏈；不連續(xù)地合成一些片段，而后連成一條隨從鏈，所以DNA復(fù)制是半不連續(xù)合成。

DNA的復(fù)制是以DNA為模板，在DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化下進(jìn)行的DNA合成反應(yīng)。合成原料為四種dNTP，合成反應(yīng)的方向為5′→3′。反應(yīng)中需要有RNA作為引物。合成產(chǎn)物DNA的序列與模板DNA的序列是互補的。細(xì)胞分裂時，通過DNA的復(fù)制作用，遺傳信息從親代DNA分子中傳到子代DNA分子中。DNA復(fù)制的全部過程可以人為地分成三個階段：第一個階段為DNA復(fù)制的起始階段，這個階段包括起始點，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成；第二階段為DNA鏈的延長，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接崗崎片段。第三階段為DNA復(fù)制的終止階段。(1)模板和合成原料新合成DNA的特異性完全取決于模板DNA。三磷酸核苷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）是合成原料。(2)酶和蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)還有許多酶和蛋白質(zhì)參與DNA的復(fù)制：螺旋酶（Helicase）可以和單鏈DNA結(jié)合，并且與ATP結(jié)合，利用ATP分解時產(chǎn)生的能量沿DNA鏈向前運動促使DNA雙鏈打開。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSBP）能很快地和復(fù)制叉方向產(chǎn)生的單鏈區(qū)單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解，并使其呈伸展?fàn)顟B(tài)，有利于單鏈DNA作為模板。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopoisomerase)催化同一DNA分子不同超螺旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的作用是使超螺旋DNA松弛化。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ?qū)⒇?fù)超螺旋引入DNA分子。負(fù)超螺旋的存在有利于DNA的雙鏈分開。引物酶（Primase）和RNA聚合酶（RNAPolymerase）大腸桿菌中引物酶催化引物RNA分子的合成。在單鏈?zhǔn)删wM13DNA和質(zhì)粒Co1E1DNA復(fù)制時，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。參與ＤＮＡ復(fù)制的物質(zhì)：(一)DNA復(fù)制的起始點很多實驗都證明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(originofreplication)常用ori或o表示。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中，每個DNA分子只有一個復(fù)制起始點，因而只有一個復(fù)制子，而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復(fù)制子。每個復(fù)制子長約50-200kb。二、DNA復(fù)制的起始階段：(1)定點開始雙向復(fù)制：這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制泡，用電子顯微鏡可以觀察到復(fù)制泡的存在：(二)DNA復(fù)制的方向：(2)定點開始單向復(fù)制：質(zhì)粒colE1是個典型的例子，復(fù)制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制叉(replicationfork)。(3)兩點開始單向復(fù)制：腺病毒DNA的復(fù)制是從兩個起點開始的，形成兩個復(fù)制叉，各以一個單一方向復(fù)制出一條新鏈：DNA的半不連續(xù)復(fù)制和復(fù)制泡的形成DNA鏈生長方向的三種機制1.解鏈酶(helicase)DNA開始復(fù)制時首先在起始點處解開雙鏈，反應(yīng)是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進(jìn)行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。(三)DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)：2.單鏈結(jié)合蛋白：(singlestrandbindingproteins,SSBP)

它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用：大腸桿菌DNA復(fù)制叉中復(fù)制過程簡圖3.引發(fā)體的形成：

DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)的，所以引發(fā)階段較復(fù)雜。(1)引物酶(primase)

它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾至數(shù)十個核苷酸不等，它們在DNA復(fù)制起始處做為引物。(2)引發(fā)體(primosome)

高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3’-端接下去合成DNA片段，這是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。DNA的復(fù)制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧單核苷酸(dATP，dGTP,dCTP,dTTP,簡寫為dNTP)聚合成DNA的過程。這是一個非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多種酶和蛋白質(zhì)參與。二、DNA復(fù)制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子：DNA復(fù)制時蛋白質(zhì)的協(xié)同作用當(dāng)DNA復(fù)制時，各種蛋白質(zhì)協(xié)同作用共同完成以下工作：1.在DNA解旋酶的作用下，兩條母鏈部分解鏈；2.DNA單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到解開的DNA單鏈上，以防兩條單鏈再次粘合；3.DNA聚合酶結(jié)合到DNA鏈上開始催化先導(dǎo)鏈和后隨鏈的延伸（DNA聚合酶也可以檢查自身工作的準(zhǔn)確性）；4.DNA聚合酶可以催化先導(dǎo)鏈連續(xù)地延伸，而在后隨鏈中則是一段一段地合成岡崎片段，這時需要DNA引物酶重復(fù)地合成RNA引物來啟動每個片段的延伸；5.最后，各個岡崎片段在DNA連接酶的作用下連接成完整的后隨鏈。(一)DNA的聚合反應(yīng)和DNA聚合酶1957年，Arthurkornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ，(DNApolymeraseⅠ,簡寫DNApolⅠ)。后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。1.DNA聚合酶Ⅰ：

DNApolⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn++，是聚合活性必須的。大腸桿菌每個細(xì)胞中約有400個酶分子，每個酶分子每分鐘在37℃下能催化667個核苷酸參入到DNA鏈中，用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水介成兩個片段，大段分子量為76KD，通常稱為klenow片段，小片段為34KD。大小片段具有不同的酶活性。DNA聚合酶I的作用它具有5′→3′聚合活性、3′→5′外切和5′→3′外切活性。(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物RNA3′端，并促進(jìn)dNTP的3′與5′端形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時才有催化作用。DNA聚合酶催化的DNA鏈延長(2)DNA聚合酶I的3′→5′外切核酸酶活性：這種酶活性主要功能是從3′→5′方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于DNA復(fù)制中極高的保真性是至關(guān)重要的。(3)DNA聚合酶I的5′→3′外切核酸酶活性：這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。

DNApolⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5′→3′方向移動，這種反應(yīng)叫做缺刻平移(nicktranslation)，利用此反應(yīng)可在體外對DNA片段進(jìn)行放射性磷(α-32PdNTP)的標(biāo)記制成探針(probe)，進(jìn)行核酸的分子雜交實驗，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的一項重要技術(shù)：缺刻平移標(biāo)記DNA探針2.DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)

此酶分子量為120KD，每個細(xì)胞約有100個酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。3.DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)

這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個多亞基組成的蛋白質(zhì)分子。DNA聚合酶Ⅲ全酶不是單獨起作用，而是與引發(fā)體、介鏈酶等構(gòu)成一個復(fù)制體(replisome)再在DNA的復(fù)制過程中發(fā)揮作用的：3.DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)

這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個多亞基組成的蛋白質(zhì)分子。DNA聚合酶Ⅲ全酶不是單獨起作用，而是與引發(fā)體、介鏈酶等構(gòu)成一個復(fù)制體(replisome)再在DNA的復(fù)制過程中發(fā)揮作用的：

酶作用DNA聚合酶Ⅰ5’－3’聚合酶及外切酶作用，3’－5’外切酶酶作用，可校正/修復(fù)DNA鏈，還可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5’－3’聚合酶及3’－5’外切酶酶作用，可校正/修復(fù)DNA鏈DNA聚合酶Ⅲ與酶Ⅰ作用類似，酶活高，是主要的鏈延伸酶（聚合酶replicase）真核生物DNA聚合酶真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它們的基本特性相似于大腸桿菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性。

真核細(xì)胞在DNA復(fù)制中起主要作用的是DNApolα，主要負(fù)責(zé)染色體DNA的復(fù)制。(二)與超螺旋松馳有關(guān)的酶：

DNA復(fù)制從起始點開始向一個方向復(fù)制時，局部的DNA雙鏈必須打開，主要靠解鏈酶的作用，打開后的單鏈還要單鏈結(jié)合蛋白與其結(jié)合，在復(fù)制叉向前移動時造成其前方DNA分子所產(chǎn)生的正超螺旋，必須由拓?fù)洚悩?gòu)酶來解決。拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶。在體外可催化DNA的各種拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，而在生物體內(nèi)它們可能參與了DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。在DNA復(fù)制時，復(fù)制叉行進(jìn)的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤神Y超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)及DNA的合成。DNA復(fù)制完成后，拓?fù)涿赣挚蓪NA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。

大腸桿菌和真核生物中的拓?fù)洚悩?gòu)酶

類型作用對超螺旋的作用Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶大腸桿菌切開一股DNA鏈松馳負(fù)超螺旋真核生物切開一股DNA鏈松馳正，負(fù)超螺旋Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶大腸桿菌切開二股DNA鏈構(gòu)馳正超螺旋；依賴ATP引入負(fù)超螺旋，解環(huán)連等真核生物切開二股DNA鏈松馳正超旋，依賴ATP但不能引入負(fù)超螺旋

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉(zhuǎn)動，然后再將切口封起來。這就使DNA復(fù)制叉移動時所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復(fù)制叉繼續(xù)向前打開。此外，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ對環(huán)狀單鏈DNA還有打結(jié)或解結(jié)作用，對環(huán)狀雙鏈DNA的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈DNA都有作用：拓?fù)涿涪窦阿虻淖饔锰攸c(a)大腸桿菌拓?fù)涿涪翊呋?種拓?fù)洚悩?gòu)化作用；(b)拓?fù)涿涪虻淖饔?/p>

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，曾被稱為旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，它們作用特點是切開環(huán)狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的部分經(jīng)切口穿過而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口，TopoⅡ還可使DNA分子從超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗神Y狀態(tài)，此反應(yīng)不需要ATP參與。DNA復(fù)制完成后，TopoⅡ在ATP參與下，DNA分子從松馳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。此外，TopoⅡ催化的拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)還有環(huán)連或解環(huán)連，及打結(jié)或解結(jié)。DNA在復(fù)制過程中，合成出的前導(dǎo)鏈為一條連續(xù)的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進(jìn)行的。連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3′、5′－磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來自ATP(或NAD＋)。連接酶先與ATP作用，以共價鍵相連生成E-MP中間體。中間體即與一個DNA片段的5′－磷酸相連接形成E-AMP-5′-DNA。然后再與另一個DNA片段的3′-OHH末端作用，E和AMP脫下，兩個DNA片段以3′、5′磷酸二酯鍵相連接。隨從鏈的各個DNA片段就是這樣連接成一條DNA長鏈：四、DNA復(fù)制的終止階段連接酶的催化反應(yīng)最近的實驗表明，在DNA上存在著復(fù)制終止位點，DNA復(fù)制可在復(fù)制終止位點處終止，不一定等全部DNA合成完畢。

DNA復(fù)制的忠實性較高，是由于原核細(xì)胞的DNApolⅠ及真核生物DNApolδ及ε均有3′→5′外切酶活性，可以校正復(fù)制中出現(xiàn)的錯誤堿基。DNA復(fù)制完成后，靠拓?fù)涿笇NA分子引入超螺旋結(jié)構(gòu)。1.參與ＤＮＡ復(fù)制的物質(zhì)三磷酸核苷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP，通稱

dNTP）是合成原料。DNA復(fù)制小結(jié)2.參與ＤＮＡ復(fù)制的模板親代的DNA雙鏈。DNA復(fù)制小結(jié)3復(fù)制過程

復(fù)制是從特定位點開始的，可以單向或雙向，雙向為主。復(fù)制的方向為5’3’，特點是半保留部連續(xù)的方式進(jìn)行。復(fù)制過程可以概括為：1）雙鏈的解開，在復(fù)制的原點雙鏈解開形成復(fù)制叉，兩條單鏈各為模板，合成互補鏈，在復(fù)制叉上結(jié)合著有關(guān)的酶及輔助因子。2）RNA引物的合成，引發(fā)體在復(fù)制叉上移動，識別合成起始點，引發(fā)rna引物的合成，再ATP供能下以DNA為模板按5’3’方向合成一段引物RNA。DNA復(fù)制小結(jié)3）DNA鏈的延長，RNA引物合成后，在DNA聚合酶催化下，以dNTP為底物進(jìn)行DNA新鏈的合成，合成的模板是親代的DNA鏈，按堿基配對原則進(jìn)行。親代的DNA雙連呈反向平行，一條鏈?zhǔn)?’3’走向，另一條鏈?zhǔn)?’5’走向。4）切出引物，填補缺口，連接修復(fù)，隨從鏈的岡崎片斷到一定長度，其3’-羥基端與前一個岡崎片段的5’-端連接時，在DNA聚合酶I的作用下切除RNA并合成一段DNA填補上，在DNA連接酶的作用下，連接相鄰的DNA鏈，修復(fù)摻入DNA鏈的錯配堿基，從而形成兩個DNA雙螺旋分子。4.復(fù)制中所需的酶和蛋白質(zhì)（1）RNA聚合酶（引物酶）（2）DNA聚合酶

DNA聚合酶I5’3’

聚合酶3’5’

外切酶5’3’

外切酶

DNA聚合酶III5’3’

聚合酶3’5’

外切酶5’3’

外切酶

DNA聚合酶II5’3’

聚合酶3’5’

外切酶

（3）DNA連接酶（4）拓?fù)洚悩?gòu)酶(旋轉(zhuǎn)酶）

拓?fù)洚悩?gòu)酶I使雙鏈DNA中一條鏈斷裂，減少負(fù)超螺旋

拓?fù)洚悩?gòu)酶II使雙鏈DNA中兩條鏈斷裂，引入負(fù)超螺旋（5）解螺旋酶（解鏈酶）水解ATP，使DNA雙鏈打開。（6）單鏈結(jié)合蛋白（SSB）（7）引發(fā)前體DNA復(fù)制小結(jié)第二節(jié)反轉(zhuǎn)錄作用(reversetranscription)1970年Temin等在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為核板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序(其中V與A配對)合成DNA。該過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)。后來發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。

反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′末端上，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA,cDNA)，它與RNA模板形成RNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程.

攜帶反轉(zhuǎn)錄酶的病毒又稱為反轉(zhuǎn)錄病毒，它侵入宿主細(xì)胞后先以病毒RNA為模板靠反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，隨后這種DNA環(huán)化并整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中去，以原病毒的形式在宿主細(xì)胞中一代代傳遞下去。又發(fā)現(xiàn)許多反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中都含有癌基因，如果由于某種因素激活了癌基因就可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。

大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要活性如下：①DNA聚合酶活性；②RNAase活性；③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成出互補的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(cDNAlibrary)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因方法。第三節(jié)DNA的損傷與修復(fù)DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)DNA分子的完整性對細(xì)胞至關(guān)重要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都經(jīng)常會導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變，而且與RNA及蛋白質(zhì)可以在胞內(nèi)大量合成不同，一般在一個原核細(xì)胞中只有一份DNA，在真核二倍體細(xì)胞中相同的DNA也只有一對，如果DNA的損傷或遺傳信息的改變不能更正，對體細(xì)胞就可能影響其功能或生存，對生殖細(xì)胞則可能影響到后代。所以在進(jìn)化過程中生物細(xì)胞所獲得的修復(fù)DNA損傷的能力就顯得十分重要，也是生物能保持遺傳穩(wěn)定性之所在。

細(xì)胞中能進(jìn)行修復(fù)的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA對生命的重要性。另一方面在生物進(jìn)化中突變又是與遺傳相對立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象，DNA分子的變化并不是全部都能被修復(fù)成原樣的，正因為如此生物才會有變異、有進(jìn)化。一、DNA的損傷(一)DNA損傷的原因1.DNA分子的自發(fā)性損傷(1)DNA復(fù)制中的錯誤以DNA為模板按堿基配對進(jìn)行DNA復(fù)制是一個嚴(yán)格而精確的事件，但也不是完全不發(fā)生錯誤的。堿基配對的錯誤頻率約為10－1－10－2

，在DNA復(fù)制酶的作用下堿基錯誤配對頻率降到約10－5－10－6

，復(fù)制過程中如有錯誤的核苷酸參入，DNA聚合酶還會暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯誤接上的核苷酸，然后再繼續(xù)正確的復(fù)制，這種校正作用廣泛存在于原核和真核的DNA聚合酶中，可以說是對DNA復(fù)制錯誤的修復(fù)形式，從而保證了復(fù)制的準(zhǔn)確性。但校正后的錯配率仍約在10－10左右，即每復(fù)制10-10個核苷酸大概會有一個堿基的錯誤。(2)DNA的自發(fā)性化學(xué)變化生物體內(nèi)DNA分子可以由于各種原因發(fā)生變化，至少有以下類型：a.堿基的異構(gòu)互變DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，這種變化就會使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生在DNA復(fù)制時，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤性損傷：腺嘌呤的稀有互變異體與胞嘧啶(a)，或胸腺嘧啶的稀有互變異構(gòu)體與鳥嘌呤(b)的氫鏈形成導(dǎo)致下一世代中G－C配對取代A－T配對b.堿基的脫氨基作用堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會變成黃嘌呤(X)等，遇到復(fù)制時，U與A配對、H和X都與C

配對就會導(dǎo)致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細(xì)胞每天190個。c.脫嘌呤與脫嘧啶自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細(xì)胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個：估計一個長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，約占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。d.堿基修飾與鏈斷裂細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo)致老化。由此可見，如果細(xì)胞不具備高效率的修復(fù)系統(tǒng)，生物的突變率將大大提高。2.物理因素引起的DNA損傷射線引起的DNA損