黃芪對(duì)糖尿病腎病大鼠nf-b、mcp-1表達(dá)的影響

黃芪對(duì)糖尿病腎病大鼠nf-b、mcp-1表達(dá)的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。DN的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚,目前認(rèn)為糖代謝紊亂、腎局部血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞因子等因素均發(fā)揮著重要的作用。NF-κB為一種與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)和細(xì)胞凋亡有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB的活化可上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成。因此,NF-κB可能與DN的發(fā)病相關(guān)。我們知道黃芪能促進(jìn)肝臟合成白蛋白,但也有研究表明其能減糖尿病腎病的蛋白尿,但其機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)將探討NF-κB在糖尿病腎病大鼠腎組織中的變化及黃芪對(duì)NF-κB表達(dá)的影響及其對(duì)糖尿病大鼠腎臟是否有保護(hù)作用。1材料和方法1.1動(dòng)物血糖正常雄性Sprague-DTwley(SD)大鼠共30只,體重210~240g(貴州省動(dòng)物中心提供),血糖正常。試劑:鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司),(貴陽(yáng)同濟(jì)堂藥店),單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)抗體、NF-κBP65抗體,SABC試劑盒(武漢博士德公司)。1.2方法1.2.1糖尿病大鼠+黃芪大鼠隨機(jī)分成3組,每組10只,分別為C組(正常對(duì)照組);DM組(糖尿病組);DT組(糖尿病大鼠+黃芪治療組)。糖尿病模型建立后,DT組予黃芪10g/(kg·d)灌胃,DM組及C組喂予等量飲用水。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、進(jìn)食,不使用胰島素及其他降糖藥物。1.2.2糖尿病大鼠模型的建立1.3樣品收集和處理1.3.1生化指標(biāo)測(cè)定20℃冷藏待測(cè);股動(dòng)脈放血5mL,葉素抗凝(1mL血加125個(gè)U),測(cè)定生化指標(biāo);處死大鼠,迅速取出右腎,4℃生理鹽水沖洗2次,小心剝?nèi)ツI包膜,腎組織橫切為約1mm的薄片,置4%多聚甲醛緩沖液中固定,行免疫組化及腎形態(tài)學(xué)觀(guān)察。1.3.2指標(biāo)的測(cè)定雅培2000型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿肌酐(Cr)、雅培2000生化測(cè)定儀測(cè)定24h尿蛋白。1.3.3免疫組織化學(xué)法測(cè)定了腎組織中nf-b和mcp-1的發(fā)現(xiàn)參照文獻(xiàn)的方法測(cè)定腎組織NF-κB和MCP-1的表達(dá)。1.4腎組織的染色腎組織切片蘇木素—伊紅(HE)和過(guò)碘酸(PAS)染色。HE染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞漿呈紅色。PAS染色后糖原呈紅色,胞核呈淡藍(lán)色。1.4.1小鼠肝腎nf-b、mcp-1、nf-b、mp-1、cp-1、mcp-1的表達(dá)情況每例標(biāo)本按左上、左下、右上、右下、中間順序取腎皮質(zhì)20個(gè)腎小球,高倍視野下(×400)分別觀(guān)察腎小球中NF-κB(細(xì)胞核呈棕褐色)、MCP-1(細(xì)胞漿呈棕褐色)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),均值表示每例腎小球中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.4.2統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間比較采用t檢驗(yàn),相關(guān)分析采用直線(xiàn)相關(guān)。P<0.05為差異有顯著意義。2結(jié)果2.1dt組小鼠血清nf-b陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較C組腎小球中可見(jiàn)少量NF-κB的表達(dá),DM組腎小球NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較C組明顯增高(P<0.01),DT組腎小球中NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較DM組減少,差異有顯著意義(P<0.05);MCP-1在C組腎小球中可見(jiàn)極少量表達(dá),DT組腎小球MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與DM組比較差異有顯著意義(P<0.05),見(jiàn)表1。2.2血胱蛋白和24h尿蛋白與C組比較,DM組血肌酐和24h尿蛋白明顯增高(P<0.01),DT組血肌酐和24h尿蛋白較DM組明顯下降(P<0.05),見(jiàn)表2。2.3dt組大鼠小鼠系膜區(qū)基質(zhì)厚度的變化HE及PAS染色光鏡觀(guān)察,C組未見(jiàn)明顯病理改變,DM組大鼠腎小球系膜區(qū)基質(zhì)中度增多,系膜細(xì)胞中度增生,小管間質(zhì)散在灶性單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn),DT組上述病理改變均有不同程度的減輕,見(jiàn)圖1,圖2,圖3,圖4。2.4腎衰竭p-b陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與血液肌腱、24小時(shí)尿蛋白之間的相關(guān)分析腎小球NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與血肌酐、24h尿蛋白量呈明顯正相關(guān),r值分別為0.79(P<0.05)和0.80(P<0.05)。3糖尿病大鼠腎組織中nf-b的變化情況糖尿病的發(fā)病率逐年上升,且糖尿病腎病一旦進(jìn)展至臨床蛋白尿期,則不可避免發(fā)展到終末期腎衰,因此,對(duì)早期糖尿病腎病進(jìn)行干預(yù)有重要意義。NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,由多肽鏈p50和p65兩個(gè)亞基組成。細(xì)胞靜息狀態(tài)下,NF-κB的p65亞基和其抑制性蛋白IκB形成復(fù)合物留在胞漿中,NF-κB處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)IκB和NF-κB解離,隨即NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),參與基因轉(zhuǎn)錄,從而在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮作用。許多與腎臟疾病進(jìn)展有關(guān)因子如MCP-1、粘附因子等的基因啟動(dòng)子中含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn),提示NF-κB可能在腎臟疾病的發(fā)病中起重要作用。Donadalli等研究發(fā)現(xiàn),在腎毒血清性腎小球腎炎中隨著NF-κB的活化,MCP-1、ICAM-1表達(dá)增高,尿蛋白也增加,間質(zhì)ED1+的單核細(xì)胞和CD8T+細(xì)胞的趨化作用也與NF-κB活性相平行。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常大鼠腎組織中NF-κB有較弱的活化,提示適量的NF-κB活化可能是調(diào)節(jié)正常腎臟細(xì)胞生理功能所必須。與正常大鼠相比較,有腎臟損害的糖尿病大鼠腎小球中NF-κB、MCP-1明顯升高,糖尿病大鼠24h尿蛋白和肌酐亦明顯增高,糖尿病大鼠腎組織中NF-κB表達(dá)與24尿蛋白和肌酐呈明顯正相關(guān),表明DN時(shí)腎組織中NF-κB被異常激活,且NF-κB表達(dá)與DN的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。DN的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果,而NF-κB的異常激活,上調(diào)細(xì)胞因子(如MCP-1、VCAM-1等)的表達(dá)及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成可能是其發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。近年的研究發(fā)現(xiàn)DN腎組織病變周?chē)Ｓ写罅繂魏思?xì)胞浸潤(rùn),浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及產(chǎn)生氧自由基促使細(xì)胞外基質(zhì)增加和小管間質(zhì)纖維化,加速腎小球硬化的進(jìn)展。目前認(rèn)為,MCP-1是介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的主要因子,而MCP-1的轉(zhuǎn)錄合成是由NF-κB調(diào)控。因此,NF-κB的異?；罨赡苁且餗CP-1表達(dá)增加的主要因素。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠腎組織中NF-κB活化和MCP-1表達(dá)明顯增加,腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多,腎小球和腎小管基底膜增厚,系膜區(qū)擴(kuò)張,小管間質(zhì)散在灶性單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生。PAS染色腎小球陽(yáng)性基質(zhì)面積比增高。由此表明,糖尿病時(shí)活化的NF-κB通過(guò)上調(diào)腎組織MCP-1表達(dá),促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞腎組織浸潤(rùn),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增加可能是DN發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。黃芪是減少蛋白尿的常用中藥之一,研究認(rèn)為黃芪能減輕糖尿病大鼠早期腎臟肥大,降低微量白蛋白的排泄,同時(shí)觀(guān)察到在免疫性腎炎鼠中,黃芪可減輕NF-κB表達(dá)的同時(shí)也降低腫瘤壞死因子(TNF)水平,下調(diào)腎組織中MCP-1的蛋白量及mRNA的過(guò)度表達(dá),從而抑制免疫反應(yīng)而發(fā)揮治療作用。我們的研究表明黃芪也能使糖尿病腎病大