腎蘇號方對腎組織內(nèi)固定治療大鼠腎小球硬化的影響

腎蘇號方對腎組織內(nèi)固定治療大鼠腎小球硬化的影響

局部腎衰竭（focalsemtsh）是難治性腎衰竭的常見類型。由于許多患者缺乏激素阻力，使用激素和免疫抑制劑的傳統(tǒng)治療方法往往難以控制疾病的發(fā)展。臨床觀察表明，中藥復(fù)方腎蘇大劑量對治療慢性腎疾病，以及降低腎臟末端風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮了積極作用。目前認(rèn)為FSGS與腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)合成和降解失衡導(dǎo)致ECM過度積聚相關(guān)。研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)作為促進(jìn)ECM沉積和組織硬化最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一,參與FSGS的病變進(jìn)程;而纖維蛋白溶解酶原激活物抑制劑-1(plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI-1)則對參與ECM降解過程的纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)的活性具有重要影響。為此,本研究探討中藥復(fù)方腎蘇Ⅱ號方對FSGS腎小球ECM積聚、TGF-β1及PAI-1的影響,觀察腎蘇Ⅱ號方干預(yù)FSGS進(jìn)展的效果及其可能機(jī)制,以期尋找可有效阻抑FSGS進(jìn)展的中醫(yī)藥干預(yù)途徑。血清因子及造模方法雄性SD大鼠,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供,體重(180±20)g,SPF/VAF級,合格證號:SCXK(津)2005-0001。腎蘇Ⅱ號方由柴胡12g黃芩10g生黃芪30g當(dāng)歸10g女貞子15g澤蘭15g水蛭10g細(xì)辛3g組成,煎煮濃縮(每毫升含生藥0.85g),裝瓶密封,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ幬锊少徏凹庸ぞ商旖蛑嗅t(yī)藥大學(xué)藥廠協(xié)助完成,經(jīng)天津市藥品檢驗(yàn)所核定。鹽酸貝那普利:規(guī)格10mg/片,購自瑞士諾華北京制藥有限公司,批號:X1167。鹽酸阿霉素:10mg/支,深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供,批號:0707E1。纖維連結(jié)蛋白(fibronectin,FN)抗體(Stantasc-69681)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ,ColⅣ)抗體(Abcamab-6586)、TGF-β1抗體(Stantasc-146)、PAI-1抗體(Stantasc-8979)及SP-9000免疫組化染色試劑盒(天津?yàn)骃P-9000);HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)。取48只健康雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,依體重分層,隨機(jī)分為空白對照組(對照組,12只)和造模組(36只)。參考張麗芬等造模方法制備SD大鼠FSGS模型。造模組大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉。常規(guī)消毒,背部切口,暴露左腎,結(jié)扎左腎門血管,切除左腎。對照組予相同麻醉及手術(shù)切口,不結(jié)扎腎門血管,不切除腎臟。造模組于術(shù)后第1、5周末按3、2mg/kg體重劑量經(jīng)尾靜脈分別注射阿霉素溶液(1mg/mL);對照組采用相同方法同時注射生理鹽水0.5mL。模型建立共需9周。模型建立后,造模組按體重分層隨機(jī)分為模型組、西藥組和中藥組,每組12只。造模第9周末,中藥組予腎蘇Ⅱ號方(3.5g/100g)灌胃,西藥組予貝那普利(0.33mg/100g)混懸液灌胃,對照組與模型組灌服等量生理鹽水,共進(jìn)行12周。實(shí)驗(yàn)全程給予普通飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過程中因左腎摘除術(shù)后感染、阿霉素腎病體質(zhì)虛弱及藥物灌胃誤入氣管,共計(jì)死亡6只。其中,對照組死亡1只、模型組死亡2只、西藥組死亡1只,中藥組死亡2只。5腎組織硬化分析于治療前,第4、8、12周末代謝籠收集大鼠24h尿液;治療前,第4、8周末大鼠目內(nèi)眥靜脈取血,第12周末大鼠腹主動脈取血,分離血清,分別檢測24h尿蛋白定量(24hU,鄰苯三酚紅法)、血尿素氮(BUN,尿素酶法)、血肌酐(SCr,肌酐酶法)、血清總蛋白(TP,雙縮脲比色終點(diǎn)法)、血清白蛋白(ALB,溴甲酚綠比色測定法)。于治療第12周末,處死大鼠,迅速剖腹取腎,剝離包膜,取部分腎組織10%中性福爾馬林固定,脫水、透明、石蠟包埋、切片(厚度3μm),HE染色,觀察腎小球和腎小管-間質(zhì)變化。腎小球硬化積分:于400倍鏡下,從各樣品每張HE切片隨機(jī)選取上、下、左、右、中各2個腎小球,采用Reji目測法對腎小球硬化程度進(jìn)行半定量分析。根據(jù)腎小球硬化程度評分,分為0～4級,共5級。其中,0級:腎小球基本正常;1級:每個腎小球硬化面積≤25%;2級:腎小球硬化面積為25%～50%(含50%);3級:腎小球硬化面積為50%～75%(含75%);4級:腎小球硬化面積為75%～100%。以選取腎小球的平均積分反映全腎平均硬化指數(shù)(GSI):GSI=[(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/每張切片腎小球總數(shù)]×100%(n1-4分別代表1-4級損害腎小球數(shù)目)。ECM與腎小球面積比(ECM/GA):行PAS染色,于400倍鏡下隨機(jī)選取各組標(biāo)本每張切片的上、下、左、右、中各2個視域,采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng),以0.207μm象素點(diǎn)長,于1.8256×104μm2測量窗下,測量視域中陽性信號的總面積及陽性信號占腎小球的面積比,分析基質(zhì)增殖程度。5.3fn、col、tgf-1和pai-1的相對含量檢測為免疫組化sp法。檢測fn、col、tgf-1和pai-1的結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示,采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1用藥前后各時間點(diǎn)比較見表1hU、BUN、SCr比較(表1)對照組各時間點(diǎn)24hU、BUN、SCr比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組治療第4周末,24hU較治療前提高(P<0.01),治療8、12周末24hU水平低于第4周末(P<0.05),但仍顯著高于治療前水平(P<0.05),BUN高于第4周末(P<0.05),且以第12周末增加最顯著(P<0.05);至第12周末,SCr亦出現(xiàn)顯著升高,高于其余各時間點(diǎn)(P<0.01)。西藥組第12周末與其他時間點(diǎn)比較24hU下降(P<0.05),BUN、SCr提高(P<0.05)。中藥組治療后各時間點(diǎn)24hU均顯著低于治療前(P<0.05),以第12周末下降最明顯(P<0.05);至治療第12周末BUN、SCr升高,與其他時間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組各時間點(diǎn)24hU、BUN、SCr均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。治療4周末西藥組、中藥組24hU開始減少,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至治療8、12周,西藥組、中藥組24hU、SCr低于模型組,且中藥組24hU低于西藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。治療第12周末,西藥組、中藥組BUN明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但中、西藥組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2對血清tp、alb水平的影響對照組各時間點(diǎn)TP、ALB比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組TP、ALB逐漸下降,至治療12周末TP、ALB水平顯著低于其他各時間點(diǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。西藥組和中藥組治療后各時間點(diǎn)TP、ALB水平與治療前比較未見明顯降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組各時間TP、ALB水平均顯著低于對照組(P<0.05,P<0.01)。治療4、8周末,西藥組和中藥組TP、ALB水平高于模型組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,治療第12周末,模型組TP、ALB水平顯著降低,與西藥組和中藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而西藥組和中藥組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3節(jié)段性硬化與腎間質(zhì)的關(guān)系治療第12周末觀察,對照組腎小球結(jié)構(gòu)正常,無硬化,毛細(xì)血管袢開放,系膜區(qū)細(xì)胞數(shù)量正常,基質(zhì)無增生。腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,間質(zhì)中偶見少量成纖維細(xì)胞及炎細(xì)胞;模型組腎小球可見明顯的節(jié)段性硬化病變,部分毛細(xì)血管腔狹窄、閉塞,腎小球硬化呈局灶、節(jié)段性分布,約50%腎小球可見不同程度硬化,10%腎小球呈球性硬化。腎小管內(nèi)蛋白管型明顯增加,小管上皮細(xì)胞顆粒變性、囊性擴(kuò)張,腎間質(zhì)內(nèi)可見明顯纖維化和炎細(xì)胞浸潤;西藥組部分腎小球呈輕度節(jié)段性硬化,腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管腔擴(kuò)張,可見蛋白管型,間質(zhì)輕度纖維化伴灶性炎細(xì)胞浸潤;中藥組腎小球硬化病變不顯著,可見少量腎小球呈輕度節(jié)段性硬化,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,管腔輕度擴(kuò)張,偶見蛋白管型,間質(zhì)未見明顯纖維化,可見少量炎性細(xì)胞浸潤。4小鼠節(jié)段硬化gsi、ecm/ga變化情況治療第12周末模型組可見球性硬化和節(jié)段性硬化的腎小球,前者病變血管袢消失,代之為PAS紅染均質(zhì)物;后者則見腎小球囊壁增厚,血管袢和系膜局灶性紅染物質(zhì)沉積。西藥組腎小球改變以節(jié)段硬化為主,主要表現(xiàn)腎小球囊壁增厚,血管袢局灶性PAS陽性物質(zhì)沉積。中藥組大部分腎小球無明顯改變,僅少數(shù)出現(xiàn)節(jié)段性硬化的改變。對照組則未見PAS陽性物質(zhì)沉積。GSI、ECM/GA比較顯示:對照組未見腎小球硬化;模型組呈不同程度腎小球硬化,GSI、ECM/GA增加,與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥組、西藥組GSI、ECM/GA均低于模型組,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中藥組GSI低于西藥組,與西藥組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。5組fn、col染色總參數(shù)比較治療第12周末對照組腎組織FN、ColⅣ免疫組化染色為陰性,未見棕黃色陽性物質(zhì)表達(dá)。模型組腎小球FN及ColⅣ染色均可見多量棕黃色陽性物質(zhì)表達(dá)。西藥組FN及ColⅣ染色呈淺黃色弱陽性表達(dá)。而中藥組FN及ColⅣ染色均為弱陽性表達(dá),表現(xiàn)為淺黃色陽性物質(zhì)呈點(diǎn)灶狀表達(dá)。與對照組比較,模型組FN、ColⅣ相對含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。西藥組與中藥組FN、ColⅣ相對含量均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中藥組亦低于西藥組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。6對小鼠肝腎tgf-1、pai-1表達(dá)的影響治療第12周末各組腎組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色結(jié)果如圖4所示。正常對照組為陰性表達(dá)。模型組TGF-β1和PAI-1染色可見多處腎小球呈強(qiáng)陽性表達(dá);西藥組兩種染色也均可以見到一定數(shù)量的腎小球呈陽性反應(yīng);中藥組可見少量腎小球有陽性表達(dá),但其表達(dá)強(qiáng)度呈淺黃色弱陽性表達(dá)。與對照組比較,模型組TGF-β1、PAI-1相對含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥組、西藥組TGF-β1、PAI-1水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而中藥組PAI-1水平亦低于西藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中藥復(fù)方對腎紅酵母大鼠腎功能的影響ECM的過度積聚是FSGS的重要病理改變。在腎小球硬化的進(jìn)程中,腎小球內(nèi)ECM過度沉積的過程在整體上以ECM合成過程增強(qiáng)及降解過程受抑制為主要表現(xiàn)。FN與ColⅣ是腎小球ECM的主要成分,研究顯示FSGS病變過程中FN與ColⅣ含量明顯增加,并隨病變進(jìn)展而加劇。因此,干預(yù)FN與ColⅣ的過度積聚是現(xiàn)階段FSGS研究還待解決的關(guān)鍵性問題之一。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞因子TGF-β1與PAI-1參與調(diào)節(jié)ECM合成與降解的動態(tài)平衡。TGF-β1作為一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,是腎小球硬化進(jìn)展的關(guān)鍵性因素。TGF-β1可通過刺激成纖維細(xì)胞增加ECM成分合成;抑制多種ECM成分降解酶活性,增強(qiáng)相關(guān)降解酶抑制物活性,抑制ECM降解;刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維細(xì)胞;增加ECM受體表達(dá),促進(jìn)ECM與細(xì)胞的相互作用等多個環(huán)節(jié)在腎臟纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。腎組織TGF-β1的過度表達(dá),可使小鼠腎小球系膜增厚,腎毛細(xì)血管袢閉塞,還可使ECM主要成分纖維蛋白與膠原蛋白的合成與增殖明顯升高,而降低TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)可抑制SHR-SP大鼠系膜細(xì)胞ECM成分的表達(dá),并降低Dahl-S大鼠尿蛋白水平。同時,在降解ECM的蛋白酶系中,纖溶酶原經(jīng)纖溶酶原激活物(plasminogenactivator,PA)作用后轉(zhuǎn)化為纖溶酶,可裂解包括FN和ColⅣ在內(nèi)的大部分ECM成分,但PA活性受其抑制物調(diào)控,以PAI-1最主要。生理常態(tài)下腎臟PAI-1表達(dá)較少,但當(dāng)腎臟出現(xiàn)纖維化病變時則PAI-1大量表達(dá),繼而PAI-1在組織內(nèi)的大量表達(dá)與活性增強(qiáng)有效抑制PA對ECM的降解,從而加速了ECM的積聚。腎蘇Ⅱ號方系經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟科多年臨床實(shí)踐結(jié)合經(jīng)方研究,篩選組合而成的具有療效優(yōu)勢的中藥復(fù)方,方用柴胡、黃芩暢達(dá)三焦;黃芪、當(dāng)歸益氣和血,扶正理虛;水蛭、細(xì)辛辛通暢絡(luò),化瘀利水。諸藥協(xié)同,疏導(dǎo)調(diào)節(jié),養(yǎng)臟和絡(luò),促進(jìn)氣血流暢,滲灌臟腑。藥理學(xué)研究證實(shí):腎蘇Ⅱ號方的主要組成藥物多可調(diào)控腎小球硬化進(jìn)程。其中,柴胡可通過抑制細(xì)胞素依賴性蛋白激酶4及原癌基因c-Jun、c-Fos表達(dá)實(shí)現(xiàn)對ECM的抑制;黃芩通過抑制12-LOmRNA表達(dá),可顯著降低ECM主要成分ColⅣ、FN、LN表達(dá);黃芪可調(diào)節(jié)Th1、Th2平衡紊亂及抑制NF-κB激活,減少腎組織MCP-1、TGF-β1表達(dá);當(dāng)歸與他藥配伍,能明顯抑制高糖條件下系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)增加,從而阻抑腎小球硬化進(jìn)展;水蛭素則可抑制硬化因子及ECM基因的表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中藥組FSGS大鼠經(jīng)治療后,腎臟功能學(xué)指標(biāo)改善明顯。病理學(xué)觀察中、西藥組損害均改善,基質(zhì)過度積聚明顯緩解,且中藥組優(yōu)于西藥組。免疫組化檢測表明,中藥組FN、ColⅣ表達(dá)顯著低于模型、西藥組,證實(shí)腎蘇Ⅱ號方可通過抑制FN、ColⅣ增加,減緩腎小球ECM過度積聚。同時,中藥組可有效抑制TGF-β1表達(dá),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但表達(dá)水平均數(shù)明顯低