黃芪外沖擊波碎石術(shù)對家兔腎組織p-選擇素的影響

黃芪外沖擊波碎石術(shù)對家兔腎組織p-選擇素的影響

外科手術(shù)（eswl）是治療尿石癥的常用方法，但也忽視了對腎臟的損傷。尤其是如果腎臟處于病理狀態(tài)，并且同時接受波波治療，損傷更嚴(yán)重。因此，正確的健康狀況以及對該領(lǐng)域的有效預(yù)防措施已成為焦點(diǎn)之一。前期研究已證實(shí)中藥黃芪能明顯減輕ESWL對腎臟的損傷,作用優(yōu)于公認(rèn)的抗沖擊波損傷藥物異博定。本研究通過觀察3種黃芪提取成分黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪總多糖對ESWL后黏附分子p-選擇素在腎臟中表達(dá)的影響,旨在進(jìn)一步探討黃芪抗沖擊波致腎損傷的有效成分及作用機(jī)制。1材料表面1.1動物69只雄性健康家兔,體重1.8～2.3kg,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。1.2試劑和儀器黃芪購自陜西省藥材公司,經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰副教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。超氧化物歧化酶SOD試劑盒、丙二醛MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;P-選擇素單克隆抗體及免疫組化試劑盒由武漢博士德公司提供。721分光光度計(上海分析儀器廠);MZ-Ⅴ型碎石機(jī)(深圳惠康公司);H-600透射式電子顯微鏡(日本日立公司);超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHZ-D真空循環(huán)水泵(河南鞏義市英峪予華儀器廠)。2方法2.1總多糖的提取黃芪粗粉用水煎煮提取3次,過濾,濾液濃縮至藥材-藥液之比為1∶2,加入95%乙醇,使含醇量達(dá)80%。靜置24h,過濾,棄去濾液,將濾渣置烘箱中低溫(55℃)烘干,得黃芪總多糖(含量約5%)。黃芪粗粉經(jīng)乙醚浸提脫脂,乙醇索氏提取至無色,過濾,回收乙醇,得提取物干膏。將干膏用適量水溶解,上聚酰胺柱,蒸餾水洗脫至無色,加甲醇洗脫,收集洗脫液,將洗脫液蒸干,得黃芪總黃酮(含量約0.5%)。洗脫液用水飽和的正丁醇萃取,至水層無皂苷顏色反應(yīng)為止,將萃取液蒸干,得黃芪總皂苷(含量約1.5%)。2.2不同劑量的黃芪總皂苷對家兔的多糖溶液及多糖含量的影響69只雄性家兔隨機(jī)分為5組即對照組、黃芪總皂苷組、黃芪總黃酮組、黃芪總多糖組,每組各16只,及假處理組5只。各黃芪成分組家兔,自ESWL前3d至后4d,每天分別空腹灌胃黃芪總皂苷150mg·kg-1·d-1、總黃酮50mg·kg-1·d-1及總多糖500mg·kg-1·d-1(均溶解至20mL)。劑量按生藥用量10g·kg-1折算,對照組及假處理組家兔以等體積生理鹽水灌胃。2.3腎損傷模型建立ESWL前以0.2%硫賁妥鈉45mg·kg-1腹腔注射麻醉,麻醉良好后,除假處理組外的所有家兔取右側(cè)臥位,用MZ-Ⅴ型碎石,B超下定位F2于右腎,電壓18kV,沖擊1500次建立腎損傷模型。假處理組家兔只進(jìn)行麻醉而未接受ESWL處理。2.4mda及sod活性檢測于沖擊后1,3,7,14d分別處死2,5,5,4只家兔,取右側(cè)腎臟組織0.5g加入4.5mL生理鹽水,制成10%腎組織勻漿,采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法分別檢測MDA含量及SOD活性。另處死假處理組家兔用于對照。2.5免疫、抗壞血酸試驗(yàn)將取出的腎臟,常規(guī)石蠟包埋切片后,逐級脫蠟水化,3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗后微波修復(fù)抗原15min,滴加正常血清封閉5min,滴加一抗(1∶100)4℃過夜,37℃孵育1.5h,PBS沖洗3次,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG)37℃孵育30min,PBS沖洗3次,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,中性樹膠封片。PBS代替一抗作空白對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):棕色為細(xì)胞染色陽性,200倍顯微鏡下計數(shù)高表達(dá)區(qū)隨機(jī)5個視野中陽性細(xì)胞數(shù)量,以陽性細(xì)胞比例>10%為陽性表達(dá)。2.6改性戊二醛固定液制備取出的腎臟迅速切成1mm3的小塊置于2.5%戊二醛固定液中固定,環(huán)氧樹脂EPON812浸透包埋,超薄切片切至50～70nm,醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后,觀察、拍照。2.7統(tǒng)計學(xué)處理方法計量資料以xˉ±sxˉ±s表示,SPSS11.0統(tǒng)計軟件,單因素方差分析比較各生化指標(biāo)組間差異,卡方(χ2)檢驗(yàn)比較P-選擇素表達(dá)差異。3結(jié)果3.1總皂苷對小鼠sod和mda指標(biāo)的影響ESWL后3d對照組腎組織勻漿SOD活性顯著下降,而MDA含量明顯升高(P<0.05),分別于1周、2周后恢復(fù)正常。黃芪總皂苷組SOD及MDA分別明顯高于和低于同期對照組水平(P<0.05),且與假處理組相比,上述指標(biāo)均無明顯差異(P>0.05);總黃酮組MDA的變化與總皂苷組相似,SOD下降的時間推至沖擊后1周;黃芪總多糖也能抑制MDA的升高,但作用不如總皂苷組與總黃酮組,SOD的變化與對照組相似(表1)。3.2腎間質(zhì)-he染色P-選擇素在正常腎臟(假處理組)幾乎不表達(dá)。對照組ESWL后24h即廣泛表達(dá)于腎小球毛細(xì)血管襻、系膜區(qū)、腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)血管內(nèi)皮,甚至髓質(zhì)也可見陽性染色(圖1)。此時HE染色見間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量浸潤的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。1周后腎小管及腎間質(zhì)P-選擇素表達(dá)減弱,而腎小球系膜區(qū)仍有表達(dá),2周后完全消失,間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞的浸潤程度也隨之減輕、消失。黃芪總皂苷組P-選擇素的陽性率及腎組織炎細(xì)胞的浸潤程度均顯著低于各組(P<0.05),與對照組相比,總黃酮組與總多糖組P-選擇素的表達(dá)無顯著差異(表2)。3.3腎紋狀緣結(jié)構(gòu)電鏡下對照組腎小球基底膜厚薄不均,足細(xì)胞變性、壞死,足突排列紊亂融合;腎小管紋狀緣結(jié)構(gòu)不清,線粒體腫脹、嵴消失。黃芪總皂苷組損傷顯著輕于對照組,基底膜連續(xù)均勻,足突排列有序整齊,各細(xì)胞器無明顯損傷,總黃酮組損傷輕于對照組但作用不如總皂苷組顯著,黃芪總多糖組的病變與對照組相似(圖2)。4p-選擇素與波浪致腎損傷的關(guān)系ESWL曾被認(rèn)為是一種完全無創(chuàng)的尿路結(jié)石治療手段,但隨著應(yīng)用的日益普及,越來越多的研究證實(shí)了沖擊波對受治腎的損傷。其機(jī)制尚未完全揭示,近來研究表明:除沖擊能量的直接作用外,自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)等與缺血再灌注損傷密切相關(guān)的生物學(xué)因素在沖擊波損傷腎臟的過程中發(fā)揮了重要作用。對腎血流量的監(jiān)測也提示,沖擊波放能與間歇的交替進(jìn)行,使腎盂內(nèi)壓力波動,腎臟反復(fù)處于不典型的缺血再灌注狀態(tài),因而多數(shù)學(xué)者認(rèn)為缺血再灌注可能是ESWL導(dǎo)致腎臟損傷的重要途徑。研究表明由黏附分子介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附級聯(lián)反應(yīng)在肝、腎等多種器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。P-選擇素作為黏附分子選擇素家族的主要成員,于炎癥早期介導(dǎo)白細(xì)胞向受損部位趨化、聚集并釋放多種炎癥介質(zhì),是啟動炎癥反應(yīng)和維持炎癥狀態(tài)的關(guān)鍵因素,抑制其表達(dá)能顯著減輕缺血再灌注造成的細(xì)胞損傷。關(guān)于P-選擇素與沖擊波致腎損傷的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報道。本研究建立家兔ESWL腎損傷模型,觀察P-選擇素的表達(dá)對沖擊波致腎損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):P-選擇素在正常腎臟中幾乎不表達(dá),而ESWL后廣泛表達(dá)于腎小球毛細(xì)血管襻、系膜區(qū),腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)小血管內(nèi)皮表面,并與炎癥細(xì)胞在腎組織的浸潤程度、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷密切相關(guān)。表明P-選擇素的異常表達(dá)及由此介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是沖擊波損傷腎臟的重要因素之一,P-選擇素通過介導(dǎo)以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞與腎組織廣泛黏附聚集,啟動炎癥反應(yīng),釋放蛋白水解酶,及各種炎癥介質(zhì),從而加劇腎臟的損傷程度。同時還發(fā)現(xiàn)沖擊后反映自由基水平的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量明顯升高,而自由基清除酶SOD活性顯著降低。結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致,證實(shí)了ESWL后局部腎組織自由基水平的升高。自由基通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)攻擊細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),造成膜通透性障礙,引發(fā)細(xì)胞損傷。至于P-選擇素的表達(dá)與自由基水平的升高是否存在關(guān)聯(lián),目前尚不清楚,有學(xué)者認(rèn)為浸潤的中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞可通過呼吸爆發(fā)釋放氧自由基,確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芪具有補(bǔ)益脾腎,行氣利水等功效,是中醫(yī)治療腎臟疾病的常用藥之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪單藥及其成分對包括缺血再灌注損傷在內(nèi)的不同類型腎臟病變都有確切保護(hù)作用,機(jī)制涉及抑制自由基、減輕局部炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)蛋白及脂質(zhì)代謝,改善血流變等多方面。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn):在3種黃芪提取成分中,黃芪總皂苷能顯著抑制ESWL后P-選擇素的表達(dá),降低體內(nèi)自由基水平,減輕炎細(xì)胞的浸潤及腎組織病理損傷程度。黃芪總黃酮與總多糖對P-選擇素