基因組學(xué)：基因組測(cè)序與序列組裝完整版

基因組測(cè)序與序列組裝基因組測(cè)序的目標(biāo)DNA測(cè)序的方法基因組測(cè)序的過程序列組裝方法其他基因組測(cè)序技術(shù)人類基因組的測(cè)序與組裝重要?jiǎng)又参锘蚪M測(cè)序的進(jìn)展11.基因組測(cè)序的目標(biāo)AGCGCCGTAAAAGCGCCGTAAAAGCGCCGTAAAAGCGCCGTAAAAGCGCCGTAAAA4紙3000/張A4紙1.5M/包（5厘米厚）人類基因組3Gb=3000Mb~2000x5cm=100m~30層樓高獲得基因組的所有序列信息22.DNA測(cè)序的方法測(cè)序原理第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)32.DNA測(cè)序的方法測(cè)序原理基于DNA聚合酶反應(yīng)基于DNA連接酶反應(yīng)基于DNA裂解反應(yīng)基于其他原理42.DNA測(cè)序的方法第一代測(cè)序技術(shù)：鏈終止法，又叫Sanger法，基于DNA聚合酶反應(yīng)FrederickSangerNobelPrizeinChemistry1980TCGAATTddGTCGAATTGddCTCGAATTGCddTTCGAATTGCTddCTCGAATTGCTCddAPolymerasePrimer5＇-TCGAATTTemplate3＇-AGCTTAACGAGTCTA……..dATPdCTPdGTPdTTPddATPdCTPddGTPddTTP52.DNA測(cè)序的方法第一代測(cè)序技術(shù)：鏈終止法，又叫Sanger法，基于DNA聚合酶反應(yīng)技術(shù)要點(diǎn)：雙脫氧核糖特殊的聚合酶：高酶活性，無外切酶活性單堿基分辨率的凝膠電泳局限性：測(cè)序長(zhǎng)度受凝膠電泳分辨率的限制62.DNA測(cè)序的方法第一代測(cè)序技術(shù)：鏈終止法，又叫Sanger法，基于DNA聚合酶反應(yīng)基于毛細(xì)管電泳的自動(dòng)化測(cè)序儀T*CGAATTddGT*CGAATTGddCT*CGAATTGCddTT*CGAATTGCTddCT*CGAATTGCTCddA無外切酶活性有外切酶活性72.DNA測(cè)序的方法第一代測(cè)序技術(shù)：化學(xué)降解法，又叫MaxamGilbert法WalterGilbertNobelPrizeinChemistry1980/eschmid/Lab17-Biol210.htm82.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，高通量，需文庫制備AAAAAAAAAAAAAAAAAAGenomicDNAmRNAsRNAfragmentationSizeselectionAdapterligation92.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，邊合成邊測(cè)序，sequencingbysynthesisIlluminaHiSeq系列測(cè)序儀102.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，邊合成邊測(cè)序，sequencingbysynthesis技術(shù)要點(diǎn)：可逆的鏈終止堿基112.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，焦磷酸測(cè)序，pyrosequencing122.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，IonTorrentSystemTheincorporationofdNTPintoagrowingDNAstrandcausesthereleaseofhydrogenandpyrophosphate.Thereleaseofhydrogenionsindicateifzero,oneormorenucleotideswereincorporated.dNTP,deoxyribonucleotideTriphosphate132.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，IonTorrentSystemReleasedhydrogensionsaredetectedbyanionsensor.Multipleincorporationsleadtoacorrespondingnumberofreleasedhydrogensandintensityofsignal.142.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，IonTorrentSystem454發(fā)明者的新作品測(cè)序反應(yīng)在微陣列芯片上的微反應(yīng)池中進(jìn)行。每個(gè)dNTP結(jié)合到延伸鏈上，會(huì)釋放出一個(gè)H+，pH值變化會(huì)導(dǎo)致電位變化。檢測(cè)每次dNTP流過的電位差變化，就能知道該dNTP是否連接上去。152.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，SOLiD，SequencingbyOligoLigationandDetection162.DNA測(cè)序的方法第二代測(cè)序技術(shù)，SOLiD，SequencingbyOligoLigationandDetection172.DNA測(cè)序的方法第三代測(cè)序技術(shù),單分子測(cè)序PacificBiosciencesSMRT(single-moleculereal-time)DNAsequencingmethod.LifeTechnologiesFRETsequencingplatformTheOxfordnanoporesequencingplatform182.DNA測(cè)序的方法第三代測(cè)序技術(shù),單分子測(cè)序，PacBioSMRTsequencingtechnology193.基因組測(cè)序的過程基因組測(cè)序策略基因組測(cè)序的覆蓋面序列間隙與物理間隙203.基因組測(cè)序的過程基因組測(cè)序策略:作圖測(cè)序法（map-basedsequencing）需要遺傳和物理圖譜，費(fèi)時(shí)-成本高-質(zhì)量好BACendsequencing~100Kb~2Kb213.基因組測(cè)序的過程基因組測(cè)序策略:全基因組鳥槍法（wholegenomeshotgunsequencing）

223.基因組測(cè)序的過程基因組測(cè)序的覆蓋面（SequenceCoverage）和測(cè)序深度（sequencingdepth）

丟失概率P0=e-m,m為測(cè)序深度，即單倍體基因組的倍數(shù)，e為自然對(duì)數(shù)底數(shù)。若m=1P0=e-1=0.37=37%若m=5P0=e-5=0.0067=0.67%若m=10P0=e-10=0.000045=0.0045%sequencingdepthgap233.基因組測(cè)序的過程序列間隙(sequencegap)與物理間隙(physicalgap)physicalgapsequencegap243.基因組測(cè)序的過程填補(bǔ)序列間隙(sequencegap)與物理間隙(physicalgap)從新的文庫中挑選克隆通過PCR將間隙序列擴(kuò)增出來測(cè)序~100Kb~2Kb25序列組裝方法重疊群contig重疊群contig支架scaffold基因組測(cè)序策略:作圖測(cè)序法（map-basedsequencing）26序列組裝方法重疊群contig支架scaffold基因組測(cè)序策略:全基因組鳥槍法（wholegenomeshotgunsequencing）10kb40kb2kb275.其他基因組測(cè)序技術(shù)重要區(qū)域的優(yōu)先測(cè)序EST測(cè)序環(huán)境共棲生物基因組測(cè)序(metagenomesequencing)286.人類基因組的測(cè)序與組裝人類基因組測(cè)序計(jì)劃相關(guān)的重大事件1984年在Utah州的Alta,WhiteRandMendelsonhnM受美國(guó)能源部(DOE）的委托主持召開了一個(gè)小型專業(yè)會(huì)議討論測(cè)定人類整個(gè)基因組的DNA序列的意義和前景（CookDeeganRM,1989)1985年5月在加州SantaCruz由美國(guó)DOE的SinsheimerRL主持的會(huì)議上提出了測(cè)定人類基因組全序列的動(dòng)議，形成了美國(guó)能源部的“人類基因組計(jì)劃”草案。1986年3月，在新墨西哥州的SantaFe討論了這一計(jì)劃的可行性，隨后DOE宣布實(shí)施這一計(jì)劃。1986年，諾貝爾獎(jiǎng)得主杜爾貝科（R.Dulbecco）在《科學(xué)》（Science）周刊撰文指出人類腫瘤研究將因?qū)NA的詳細(xì)知識(shí)而得到巨大推動(dòng)。1986年遺傳學(xué)家McKusickV提出從整個(gè)基因組的層次研究遺傳的科學(xué)稱為“基因組學(xué)”1987年初，美國(guó)能源部和國(guó)立衛(wèi)生研究院為HGP下?lián)芰藛?dòng)經(jīng)費(fèi)約550萬美元（全年1.66億美元）1988年，美國(guó)成立了“國(guó)家人類基因組研究中心”由WatsonJ出任第一任主任1990年10月1日，經(jīng)美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)美國(guó)HGP正式啟動(dòng)，總體計(jì)劃在15年內(nèi)投入至少30億美元進(jìn)行人類全基因組的分析。296.人類基因組的測(cè)序與組裝人類基因組測(cè)序計(jì)劃相關(guān)的重大事件1987年，意大利共和國(guó)，國(guó)家研究委員會(huì)，其特點(diǎn)是技術(shù)多樣（YAC，雜種細(xì)胞，cDNA等）、區(qū)域集中（基本上限于Xq24-qter區(qū)域）1989年2月英國(guó)，帝國(guó)癌癥研究基金會(huì)與國(guó)家醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)（ICRP-MRC），Sanger中心（線蟲基因組，改進(jìn)大規(guī)模DNA測(cè)序技術(shù)；同時(shí)建立了YAC庫的篩選與克隆。1990年6月法蘭西共和國(guó)，科學(xué)研究部，國(guó)家醫(yī)學(xué)科學(xué)院，主要特點(diǎn)是注重整體基因組、cDNA和自動(dòng)化；全基因組YAC重疊群、微衛(wèi)星標(biāo)記（遺傳圖）的構(gòu)建。1990年，美國(guó)能源部（DOE）與國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）共同啟動(dòng)HGP，原定投入30億美元，用15年時(shí)間完成該計(jì)劃。英、日、法、德等國(guó)相繼加入。1990年6月歐共體通過了“歐洲人類基因組研究計(jì)劃”，主要資助23個(gè)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)用于“資源中心”的建立和運(yùn)轉(zhuǎn)。還有丹麥王國(guó)、俄羅斯聯(lián)邦、日本、韓國(guó)、澳大利亞等。1994年，中國(guó)HGP在吳旻、強(qiáng)伯勤、陳竺、楊煥明的倡導(dǎo)下啟動(dòng)，最初由國(guó)家自然科學(xué)基金會(huì)和863高科技計(jì)劃的支持下，先后啟動(dòng)了“中華民族基因組中若干位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)的研究”和“重大疾病相關(guān)基因的定位、克隆、結(jié)構(gòu)和功能研究”。1995年德意志聯(lián)邦共和國(guó)開始HGP，來勢(shì)迅猛，先后成立了資源中心和基因掃描定位中心，并開始對(duì)21號(hào)染色體的大規(guī)模測(cè)序工作。306.人類基因組的測(cè)序與組裝人類基因組測(cè)序計(jì)劃相關(guān)的重大事件1998年5月11日，美國(guó)PEBiosystems公司，成立了CeleraGenomics公司，宣稱要在3年內(nèi)，以所謂的“人類全基因組霰彈法測(cè)序策略”完成人類基因組測(cè)序，并聲稱要專利200～400個(gè)重要基因，并將所有序列信息保密3個(gè)月。Celera公司此舉，是對(duì)公益性的HGP的競(jìng)爭(zhēng)與挑戰(zhàn)1998年，組建了中科院遺傳所，1998年在北京成立了北方人類基因組中心。1999年7月在國(guó)際人類基因組注冊(cè)，得到完成人類3號(hào)染色體短臂上一個(gè)約30Mb區(qū)域的測(cè)序任務(wù)，該區(qū)域約占人類整個(gè)基因組的1%。中國(guó)因此成為參加這項(xiàng)研究計(jì)劃的唯一的發(fā)展中國(guó)家。2000年6月26日，參加人類基因組工程項(xiàng)目的美國(guó)、英國(guó)、法蘭西共和國(guó)、德意志聯(lián)邦共和國(guó)