白喉診斷標(biāo)準(zhǔn)與處置原則

白喉診療原則及解決原則GB15997—1995前言白喉是由白喉?xiàng)U菌引發(fā)的急性呼吸道傳染病。其感染特性為咽、喉、鼻部等處粘膜充血，腫脹并有灰白色假膜形成，以及細(xì)菌外毒素引發(fā)的全身中毒癥狀，嚴(yán)重者常合并心肌炎和末梢神經(jīng)麻痹。由于白喉菌苗(百白破三聯(lián)制劑)的廣泛應(yīng)用，典型白喉逐步減少，不典型白喉或輕型白喉日漸增多，特別成人白喉的發(fā)病應(yīng)引發(fā)關(guān)注。本原則在制訂過(guò)程中，參考了1989年衛(wèi)生部制訂的《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》及《中華人民共和國(guó)傳染病防治法實(shí)施方法》，盡量結(jié)合我國(guó)流行病學(xué)，臨床實(shí)踐和各地狀況，方便易于實(shí)施和應(yīng)用。本原則的附錄A是原則的附錄；本原則的附錄B、附錄C都是提示的附錄。本原則由中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部提出。本原則起草單位：中國(guó)防止醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所、北京市地壇醫(yī)院、首都兒科研究所。本原則重要起草人：張榮珍、楊立信、王樹(shù)山。本原則由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負(fù)責(zé)解釋。1范疇本原則規(guī)定了白喉的診療原則和解決原則。本原則合用于各級(jí)、各類(lèi)醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機(jī)構(gòu)和人員對(duì)白喉病人的診療、報(bào)告和解決。2診療原則應(yīng)根據(jù)流行病學(xué)資料、臨床體現(xiàn)及咽拭子細(xì)菌學(xué)涂片成果做出臨床診療；確診則需白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)陽(yáng)性，且證明能產(chǎn)生毒素或檢出白喉特異性抗體。3診療原則3.1流行病學(xué)史白喉流行地區(qū)，與確診白喉病人有直接或間接接觸史。3.2臨床癥狀發(fā)熱、咽痛、鼻塞、聲音嘶啞、犬吠樣咳嗽。鼻、咽、喉部有不易剝落的灰白色假膜，剝時(shí)易出血。3.3實(shí)驗(yàn)室診療3.3.1白喉棒狀桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性并證明能產(chǎn)生外毒素，見(jiàn)附錄A。3.3.2咽拭子直接涂片鏡檢可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性棒狀桿菌，并有異染顆粒。3.3.3病人雙份血清特異性抗體四倍以上增加，見(jiàn)附錄C。3.4病例分類(lèi)3.4.1疑似病例含有3.2者。3.4.2臨床診療病例疑似病例加3.3.2，參考3.1。3.4.3確診病例疑似病例加3.3.1、3.3.3任何一條者。4防治原則4.1對(duì)病人的隔離發(fā)現(xiàn)疑似或診療病例，應(yīng)立刻隔離，隔離期至癥狀消失后，咽拭子兩次細(xì)菌培養(yǎng)陰性為止，或癥狀消失后14d。4.2終末消毒病人隔離后對(duì)病家以及病愈出院后，對(duì)其病室均應(yīng)進(jìn)行終末消毒?？捎煤认緞?。4.3治療原則4.3.1盡早，一次足量予以白喉抗毒素?？股厥走x青霉素殺滅病原菌，減少毒素的分泌。4.3.2采用對(duì)癥治療和防治并發(fā)癥，特別是心肌炎的防治。4.4對(duì)易感者的應(yīng)急方法4.4.1對(duì)病人周邊未發(fā)病的易動(dòng)人群，應(yīng)采用應(yīng)急接種白喉類(lèi)毒素。4.4.2對(duì)體弱多病的易感兒則可在錫克氏實(shí)驗(yàn)(白喉毒素皮膚實(shí)驗(yàn))陽(yáng)性后肌注白喉抗毒素。4.4.3對(duì)親密接觸者，應(yīng)檢疫7d。對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的帶菌者，應(yīng)予以抗生素治療。4.5白喉的免疫防止在白喉流行地區(qū)，用白喉類(lèi)毒素應(yīng)急接種，對(duì)控制流行效果十分明顯。按照我國(guó)現(xiàn)行的免疫程序，做好常規(guī)基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫，并確保接種質(zhì)量，就能控制白喉的發(fā)生。附錄A(原則的附錄)白喉病原學(xué)診療辦法A1白喉?xiàng)U菌的分離培養(yǎng)和鑒定從病人咽部假膜或鼻咽部采集標(biāo)本分離病原體。A2標(biāo)本的采集A2.1病人以無(wú)菌棉拭子或無(wú)菌棉拭子吸附新鮮配制的亞碲酸鉀、甘油鹽水保存液從疑似患者咽喉假膜邊沿蘸取標(biāo)本或同時(shí)采用鼻咽拭子，放入滅菌試管內(nèi)同時(shí)送檢。A2.2帶菌者或疑似病人由于未見(jiàn)到明顯的假膜，故應(yīng)采集鼻咽部或扁桃體粘膜上的分泌物送檢。A3鼻咽拭子接種呂氏血清斜面或亞碲酸鉀培養(yǎng)基等作細(xì)菌培養(yǎng)觀察鑒定A3.1菌型革蘭氏陽(yáng)性細(xì)長(zhǎng)桿菌呈棒狀，排列不規(guī)則，常呈人字形、柵欄狀。龐氏染色可見(jiàn)異染顆粒。A3.2培養(yǎng)及生化特性白喉?xiàng)U菌在血平板上形成灰白色、圓形光滑菌落，有溶血環(huán)。在亞碲酸鉀血平板上，菌落呈中心黑色或灰黑色，邊沿帶灰色。在尿素卵黃雙糖培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃12～48h培養(yǎng)后可做初步鑒定。白喉?xiàng)U菌發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖、甘露醇，普通不分解蔗糖。不產(chǎn)生吲哚，能還原硝酸鹽，酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，不液化明膠，不分解尿素。重型白喉?xiàng)U菌能分解淀粉、糖原和糊精，緩慢分解蔗糖。根據(jù)形態(tài)、培養(yǎng)、生化特性可將白喉?xiàng)U菌分為輕、中、重三型。A4毒力實(shí)驗(yàn)白喉是由白喉?xiàng)U菌引發(fā)的急性傳染病，其致病因素為外毒素?？乖詮?qiáng)，毒性激烈。白喉?xiàng)U菌不是全部菌株都有毒力，只有那些攜帶β－棒狀桿菌噬菌體的菌株才干產(chǎn)生外毒素。毒力實(shí)驗(yàn)可測(cè)定白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生外毒素的能力，慣用的辦法有兩種。A4.1艾立克(Elek)氏平板毒力實(shí)驗(yàn)將Elek培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至50℃左右，加入正常無(wú)菌(兔或牛)血清2mL，混勻后用無(wú)菌鑷子取預(yù)先制好的白喉抗毒素(每毫升含5000～10000u)，干燥濾紙條貼于平板中央表面，置37C孵箱內(nèi)約0.5h，烘干表面水分，時(shí)間不適宜過(guò)長(zhǎng)，以免影響成果。將實(shí)驗(yàn)菌株劃線接種于平板上成始終線，使其與抗毒素濾紙成直角相交。同一平板可同時(shí)接種4～5個(gè)標(biāo)本。同時(shí)要用已知有毒菌株作陽(yáng)性對(duì)照。于37℃培養(yǎng)48～72h，如發(fā)育良好即可觀察成果。陽(yáng)性者于距紙條稍遠(yuǎn)處沿接種線開(kāi)始有絮狀沉淀弧出現(xiàn)。若干72h仍未出現(xiàn)沉淀弧者可作陰性報(bào)告。A4.2豚鼠皮內(nèi)接種毒力實(shí)驗(yàn)將待試菌株接種呂氏血清斜面，于37℃培養(yǎng)16～18h，加肉湯1mL，刮下菌苔，使成懸液，吸取此菌液0.5mL，加入3.5mL肉湯中，混勻后即可應(yīng)用。同時(shí)要用已知有毒菌株作對(duì)照。選體重250g左右豚鼠兩只，一只在實(shí)驗(yàn)前24h腹腔注射白喉抗毒素1000u，作為對(duì)照動(dòng)物；另一只不注射抗毒素，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。接種前先將動(dòng)物腹部向上，固定在架上。以溫水洗凈腹部后剃毛。剃毛后再用無(wú)菌生理鹽水擦洗一次待干，用1mL注射器吸取菌液，精確注射0.1mL于皮內(nèi)，可同時(shí)接種6～8株菌。注射后4h，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射抗毒素4000u，以免因毒株毒力太強(qiáng)而致死。注射后經(jīng)24、48、72h，各觀察皮內(nèi)反映一次。對(duì)照動(dòng)物無(wú)論接種有毒或無(wú)毒菌株，均應(yīng)無(wú)局部反映；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射有毒株的部位，于24h呈紅腫，48h在紅腫部位邊沿有化膿性病變，72h可見(jiàn)硬塊，出現(xiàn)灰黑色壞死斑，無(wú)毒的菌株則無(wú)病變。動(dòng)物毒力實(shí)驗(yàn)也可應(yīng)用家兔及小雞作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。附錄B(提示的附錄)白喉毒素實(shí)驗(yàn)(錫克氏實(shí)驗(yàn))白喉毒素實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)定機(jī)體對(duì)白喉的易感性及判斷白喉防止接種后與否產(chǎn)生免疫力。B1辦法在兩前臂掌側(cè)上1/3處，左臂皮內(nèi)注射白喉毒索液0.1mL，右臂皮內(nèi)注射對(duì)照液0.1mL。B2反映的觀察與判斷陰性反映：兩臂注射處無(wú)任何反映為陰性反映。兩臂注射處稍有紅色硬塊，顏色較淺，界限不清，紅色消退快，不留痕跡，在24～36h最為明顯，48～72h基本消退，為假陽(yáng)性。陰性和假陽(yáng)性反映表達(dá)對(duì)白喉有免疫力，但感染量大時(shí)仍可得病。陽(yáng)性反映：注射對(duì)照液處呈陽(yáng)性反映或假陰性反映(48～72h基本消退)，而注射實(shí)驗(yàn)液處呈現(xiàn)紅色團(tuán)塊，界限分明，直徑達(dá)1cm以上，普通于注射后24～48h開(kāi)始出現(xiàn)，72～96h最明顯，7d后來(lái)逐步消退，遺留一種褐色斑，數(shù)周至數(shù)月后能夠退凈。陽(yáng)性反映表達(dá)對(duì)白喉無(wú)免疫力。附錄C(提示的附錄)血清學(xué)診療辦法C1間接血凝法測(cè)定白喉抗體C1.1原理間接血凝法是運(yùn)用紅血球作為載體，并通過(guò)一定解決后，使蛋白質(zhì)抗原吸附于紅血球表面，此種血球稱(chēng)為致敏血球。然后用致敏血球來(lái)測(cè)定對(duì)應(yīng)的微量抗體。當(dāng)特異抗體存在時(shí)，發(fā)生抗原抗體結(jié)合，血球就出現(xiàn)凝集，為陽(yáng)性反映。C1.2材料C1.2.1抗原作致敏血球用。白喉類(lèi)毒素含量為20～30Lf/mL以上。C1.2.2原則抗毒素每毫升含10個(gè)國(guó)際單位，用以測(cè)定致敏血球效價(jià)，用前須進(jìn)行56℃，30min滅活。C1.2.3血球健康綿羊血球(血球保存液保存)。C1.2.4實(shí)驗(yàn)溶液配制C1.2.4.10.15mol/L磷酸鹽和食鹽溶液配制C1.2.4.1.10.15mol/LNa(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)Na(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)·12H(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)O(M.W＝358.16)53.72g蒸餾水至1000mLC1.2.4.1.20.15mol/LKH(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)PO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)KH(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)PO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)(M.W＝136.09)20.41g蒸餾水至1000mLC1.2.4.1.30.15mol/LNaClNaC1(M.W＝58.45)8.77g蒸餾水至1000mLC1.2.4.2pH7.2磷酸鹽緩沖液(P.B.S)0.15mol/LNa(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)286mL0.15mol/LKH(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)PO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)90mL0.15mol/LNaCl376mL配后測(cè)pH值，滅菌后備用。C1.2.4.3pH6.4磷酸鹽緩沖液(P.B.S)0.15mol/LNa(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)100mL0.15mol/LKH(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)PO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)210mL0.15mol/LNaCl310mL配后測(cè)pH值，滅菌后備用。C1.2.4.4pH8.2磷酸鹽緩沖液(P.B.S)0.15mol/LNa(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)HPO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)97mL0.15mol/LKH(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)PO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)3mL配后測(cè)pH值，滅菌后備用。C1.2.4.5戊二醛稀釋液pH8.2磷酸鹽緩沖液(P.B.S)100mL0.15mol/LNaCl900mL蒸餾水500mL滅菌后放冷庫(kù)備用。C1.2.4.61％戊二醛溶液25％戊二醛溶液4mL戊二醛稀釋液96mLC1.2.4.71％鞣酸溶液鞣酸1g蒸餾水加至100mL4℃避光保存可用一周，用前以生理鹽水稀釋至1∶0。C1.2.4.8血球保存液葡萄糖2.05g枸櫞酸鈉0.8gNaCl0.42g蒸餾水加至100mL測(cè)pH，需用10％枸櫞酸校正至pH6.15，于0.7kPa消毒20min。C1.3致敏血球制備C1.3.1血球采集與解決選擇健康綿羊靜脈采血，注入血球保存液中(血球與保存液比例為1∶1)，搖勻放冷庫(kù)(2～8℃)48h，離心棄上清，用生理鹽水洗滌血球三次，每次離心(～2500r/min)20～25min，棄上清得壓積血球。C1.3.2血球醛化取上述壓積血球1份，加入24份冷卻的1％戊二醛溶液中，放2～6℃，固定時(shí)間不不大于等于30min，每5～6min搖動(dòng)一次，離心(r/min，10min)棄上清，用生理鹽水洗五次，再用蒸餾水洗五次，最后用生理鹽水配成10％血球懸液，加入1∶10000硫柳汞防腐，放2～8℃冷庫(kù)備用。C1.3.3血球致敏10％醛化血球懸液，白類(lèi)用pH7.2磷酸鹽緩沖液(P.B.S)稀釋至2.5％后進(jìn)行鞣酸解決。a)鞣酸解決2.5％血球一份加1∶10000的鞣酸一份，混勻后放45℃或37℃水浴30min(每5～6min搖一次)，然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液(P.B.S)洗滌三次(～2500r/min，5～6min)，最后用pH6.4磷酸鹽緩沖液(P.B.S)配成2.5％鞣化血球懸液。b)致敏2.5％鞣化血球一份加精制白喉類(lèi)毒素一份(25Lf/mL)加pH6.4磷酸鹽緩沖液(P.B.S)三份置45℃或37℃水浴30min(須經(jīng)常搖動(dòng))，離心棄上清，用0.5％兔血清生理鹽水洗滌二次，再用0.5％兔血清生理鹽水配成2.5％血球懸液。C1.3.4對(duì)照血球制備2.5％鞣化血球一份加4份pH6.4磷酸鹽緩沖液(P.B.S)置45℃或37℃水浴30min(須經(jīng)常搖動(dòng))，離心棄上清，用0.5％兔血清生理鹽水洗滌血球二次，再用兔血清生理鹽水配成2.5％對(duì)照血球懸液。C1.4效價(jià)滴定C1.4.1致敏血球、敏感度的測(cè)定將原則白喉抗毒素用0.5％兔血清生理鹽水先行稀釋使每毫升含1個(gè)單位，然后再以倍比法進(jìn)行一系列稀釋?zhuān)?∶2～1∶4096，每個(gè)稀釋度取一滴(0.025mL)加入血凝板孔中，再加入致敏血球一滴(0.025mL)，搖勻放37℃2h，取出判讀成果或放冰箱，次晨判讀成果，以“＋＋”為凝集實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。白喉類(lèi)毒素致敏血球的敏感度不能低于0.003906IU/mL。同時(shí)作兩種對(duì)照：a)不同稀釋度抗血清加鞣化血球，以檢查抗血清有無(wú)非特異性凝集；b)0.5％兔血清生理鹽水加致敏血球以檢查血球有否自凝作用。以上兩種對(duì)照皆為陰性實(shí)驗(yàn)才干成立，否則應(yīng)重試。C1.4.2待檢血清解決a)經(jīng)56℃30min滅活。b)醛化血球吸取。吸取辦法：待檢血清1份加50％醛化血球2份，放37℃1～2h，離心沉淀，吸取上清即為1∶2稀釋的血清樣品。C1.4.3待檢血清滴定先在血凝板中每孔加入0.5％兔血清生理鹽水一滴(0.025mL)，再將待檢血清用微量滴管滴入第一孔中(0.025mL)，使與0.5％兔血清生理鹽水混合，注意不要發(fā)憤怒泡，混勻血清后，每孔均取0.025mL，加入到第二孔中?；靹蚝笞缘诙字形?.025mL到第三孔中，如這類(lèi)推，最后一孔取出0.025mL棄掉。或用0.025mL的稀釋棒自第2孔開(kāi)始作系列稀釋。用微量滴管吸取0.025mL0.5％致敏血球加到每個(gè)孔中，加時(shí)滴管勿碰到孔壁，以免沾有抗血清。然后搖勻，放37℃2h取出，放2～10℃冰箱內(nèi)次日晨判讀成果，以“＋＋”為凝集實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。每份待檢血清可做三個(gè)稀釋度抗血清加鞣酸血球的對(duì)照，稀釋辦法如前所述(即1∶2，1∶4，1∶8)，以排除血清中非特異凝集。C1.4.4成果計(jì)算待檢血清單位＝待檢血清終點(diǎn)稀釋度×原則血清終點(diǎn)稀釋度所含單位數(shù)。例如原則白喉抗毒素(10IU/mL)終點(diǎn)稀釋度為1∶2048，含有0.0048IU/mL，而待檢血清終點(diǎn)稀釋度為1∶8，于是其單位為0.038IU/mL。C1.4.5成果鑒定原則a)凝集的紅血球均勻地鋪在孔底形成一薄層為“＋＋＋＋”；b)凝集的紅血球基本同a)，只是在此薄層的底部有一很弱紅圈為“＋＋＋”；c)凝集的紅血球在孔底形成的薄層，同時(shí)中間可見(jiàn)一松散的紅圈為“＋＋”；d)凝集的紅血球在孔底形成一圓圈，周邊可見(jiàn)少量的紅血球比對(duì)照?qǐng)A圈稍大為“＋”；e)血球在孔底形成緊密的圓圈成圓點(diǎn)為“－”。影響血凝實(shí)驗(yàn)的精確性與敏感度因素諸多，如用品的清潔，材料的原則化，操作的細(xì)致等。C2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白喉毒素抗體C2.1原理運(yùn)用包被在固相載體上白喉類(lèi)毒素捕獲待檢血清中對(duì)應(yīng)抗毒素抗體，再用酶標(biāo)記的抗人IgG抗體去掉反映(抗原－抗體－酶標(biāo)記抗抗體)，運(yùn)用底物使酶顯色而測(cè)知與否存在抗體。C2.2材料C2.2.1抗原精制白喉類(lèi)毒素1110Lf/mL。C2.2.2結(jié)合物羊抗人IgG酶標(biāo)記抗體。C2.2.3載體1cm×4cm聚苯乙烯塑料管平底帶蓋。C2.2.4底物鄰苯二胺。C2.2.5參考血清多份間接血凝法陽(yáng)性高效價(jià)血清混合為陽(yáng)性參考血清，多份陰性血清混合為陰性參考血清。C2.2.6被檢血清白喉暴發(fā)流行區(qū)的病人和健康者。C2.2.7測(cè)定儀721型分光光度計(jì)。C2.3辦法及環(huán)節(jié)C2.3.1包被抗原量及被檢血清最適稀釋倍數(shù)的擬定用陽(yáng)性及陰性參考血清與抗原作方陣式滴定，擬定本實(shí)驗(yàn)包被抗原濃度為20μg/mL，被檢血清最適起始稀釋度為1∶40。C2.3.2參考血清原則曲線繪制陽(yáng)性及陰性參考血清均從1∶40開(kāi)始至10240二倍法稀釋?zhuān)从吵晒?21型分光光度計(jì)測(cè)光密度OD值，γ＝492nm。本實(shí)驗(yàn)取三次測(cè)定成果的均值，以血清稀釋度為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，畫(huà)曲線；然后用有關(guān)回歸法擬定OD值與血清稀釋倍數(shù)相對(duì)應(yīng)的原則曲線。陽(yáng)性血清最高OD值為0.6，最低為0.1。因陽(yáng)性和陰性血清呈明顯差別的界限OD值為0.3處，故擬定OD值不不大于等于0.3為陽(yáng)性，其所對(duì)應(yīng)的血清稀釋度為1∶2560，即為一種單位。每份被檢血清稀釋度為1∶40，效價(jià)從原則曲線查出。經(jīng)測(cè)算，兩系數(shù)的P值皆不大于0.01。C2.3.3抗原包被每管加已稀釋好的抗原1.0mL，放4℃過(guò)夜，然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液(P.B.S)－吐溫20洗滌三次，兩次之間靜止3min。C2.3.4加被檢血清1.0mL，置室溫2h，再洗滌三次，辦法同前。C2.3.5加結(jié)合物(1∶8000)1.0mL，室溫2h，洗滌同前。C2.3.6加底物液(0.04％)1.0mL，室溫下30min，加2mol/L硫酸0.015mL，如終止反映立刻測(cè)OD值。C3固相放射免疫法測(cè)白喉抗體C3.1基本原理固相放射免疫分析法(SPRIA)是應(yīng)用雙抗體法，以純化的白喉類(lèi)毒素吸附到固相載體上，加入特異性抗血清，載體上形成抗原－抗體復(fù)合物。然后再加入標(biāo)有同位素的第二抗體，就形成抗原－抗體－抗抗體復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記的第二抗體的放射