第二十章 全身用藥的毒性研究

藥物毒理學(xué)第二十章

全身用藥的毒性研究第一節(jié)急性毒性試驗(yàn)

第二十章

全身用藥的毒性研究一、概念和目的急性毒性試驗(yàn)：是指機(jī)體(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)一日內(nèi)一次或多次接觸藥物產(chǎn)生毒性反應(yīng)，甚至引起死亡。常用急性毒性評(píng)價(jià)參數(shù)絕對(duì)致死劑量或濃度（LDl00，LCl00）：指試驗(yàn)中引起一群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部死亡的最低劑量和濃度。半數(shù)致死劑量或濃度(LD50，LC50)指藥物能引起一群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50％死亡所需的劑量或濃度。近似致死劑量或濃度(ALD，ALC)：指試驗(yàn)中引起一群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的大致劑量或濃度范圍。最小致死劑量或濃度(MLD，MLC)：指試驗(yàn)中引起一群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中僅個(gè)別動(dòng)物死亡的劑量或濃度。最大耐受劑量(MTD，LC0)：指實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物不引起死亡的最大劑量或濃度。闕劑量或濃度：指試驗(yàn)中動(dòng)物對(duì)某項(xiàng)敏感指標(biāo)出現(xiàn)毒效應(yīng)的最低劑量或濃度，而且在該劑量下任何劑量不應(yīng)再出現(xiàn)毒效應(yīng)，也稱最小毒性劑量或濃度。最大無(wú)作用劑量(ED0，EC0)：指實(shí)驗(yàn)中用現(xiàn)代的檢測(cè)方法和靈敏觀察指標(biāo)，不能檢測(cè)出任何損害作用的最高劑量或濃度?；緹o(wú)害劑量(LD5)基本有效劑量(ED95)主要目的為：1．了解新藥急性毒性的強(qiáng)弱以半數(shù)致死量LD50為例，化合物的LD50越小毒性越強(qiáng)。治療指數(shù)：是指LD50與半數(shù)有效量ED50間的比值。新藥研究早期主要用治療指數(shù)來(lái)衡量候選化合物的安全性，治療指數(shù)至少大于10，才具有進(jìn)一步作其他新藥臨床前研究的價(jià)值。安全系數(shù)：是指基本無(wú)害劑量LD5與基本有效劑量ED95之間的比值，比值越大越安全。

2．為長(zhǎng)期毒性和特殊毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)置提供依據(jù)

3．獲取新藥毒性反應(yīng)信息

4．新藥研制過(guò)程中，工藝路線尚未定型時(shí)，對(duì)產(chǎn)品除了理化性質(zhì)分析外，還可通過(guò)LD50值的比較，觀察生物效應(yīng)的顯著差異，以明確試驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。此外，研究復(fù)方制劑新藥時(shí)，還應(yīng)判斷配伍后與單藥應(yīng)用的毒性大小的差別。二、基本內(nèi)容急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、適應(yīng)證特點(diǎn)和試驗(yàn)?zāi)康牡冗x擇合理的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并結(jié)合其他藥理毒理研究信息對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。急性毒性試驗(yàn)應(yīng)符合一般動(dòng)物試驗(yàn)的基本原則，即隨機(jī)、對(duì)照和重復(fù)。(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇目前藥物的急性毒性試驗(yàn)應(yīng)采用至少兩種哺乳動(dòng)物。一般應(yīng)選用一種嚙齒類動(dòng)物加一種非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。若未采用非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行，則應(yīng)闡明其合理性。小鼠體重18-22g，大鼠體重160-180g犬的年齡一般為4—6月齡，猴的年齡一般為2—3歲動(dòng)物體重每組的差別要求不超過(guò)±10％。通常采用兩種性別的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，雌雄各半。若采用單性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，則應(yīng)闡明其合理性。通常采用健康成年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。如果受試物擬用于兒童或可能用于兒童，建議必要時(shí)采用幼年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。(二)劑量與分組

LD50測(cè)定方法：通過(guò)預(yù)試找出0及100％接近致死劑量正式試驗(yàn)，小鼠一般分4—6個(gè)劑量組，各劑量組距一般為0．65-0．85等比級(jí)數(shù)為宜，每組10只。對(duì)于非嚙齒類動(dòng)物給予出現(xiàn)明顯毒性的劑量即可，給藥劑量沒(méi)有必要達(dá)到致死水平。給藥劑量應(yīng)從未見(jiàn)毒性劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性(危及生命的)劑量，同時(shí)設(shè)空白和(或)溶媒(輔料)對(duì)照組。(三)給藥途徑和給藥容積兩種以上給藥途徑，其中一種必須推薦臨床用藥的途徑。對(duì)溶于水的藥物必須測(cè)定靜脈注射的LD50除非實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上無(wú)法進(jìn)行時(shí)，則作特殊說(shuō)明?？捎脛e的給藥途徑。給藥容積，各組動(dòng)物一般用不同濃度同體積給藥。常規(guī)給藥體積小鼠為0．2-0．4ml／10g，大鼠1-2ml／100g，特殊情況另作說(shuō)明。(四)觀察紀(jì)錄及結(jié)果處理給藥當(dāng)天，尤其是給藥4小時(shí)內(nèi)應(yīng)認(rèn)真觀察，并記錄，然后連續(xù)觀察7-14天，詳細(xì)記錄動(dòng)物毒性反映情況和死亡情況，中毒癥狀，中毒發(fā)生時(shí)間，持續(xù)時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間，動(dòng)物發(fā)生死亡過(guò)程、死亡時(shí)間和各組死亡分布情況。對(duì)中毒表現(xiàn)觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、黏膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主活動(dòng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。

對(duì)所有的試驗(yàn)動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行大體解剖，包括試驗(yàn)過(guò)程中因?yàn)l死而處死的動(dòng)物、死亡的動(dòng)物以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍存活的動(dòng)物。任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，均應(yīng)記錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。三、最大給藥量測(cè)定法當(dāng)藥物用最大允許濃度和最大允許容量給予動(dòng)物時(shí)，仍未測(cè)出LD50，可只求MTD值。即用最大濃度和最大允許容量一次或一日2—3次給20只動(dòng)物(雌雄各半)后，連續(xù)觀察7-14天，未見(jiàn)任何動(dòng)物死亡，即為最大給藥量。四、近似致死劑量法該方法主要用于非嚙齒類的動(dòng)物試驗(yàn)。試驗(yàn)方法如下：一般采用6只健康的Beagle犬或猴。犬的年齡一般為4—6月齡，猴的年齡一般為2—3歲，選用其他動(dòng)物時(shí)應(yīng)說(shuō)明理由。根據(jù)小動(dòng)物的毒性試驗(yàn)結(jié)果、受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其他有關(guān)資料，估計(jì)可能引起毒性和死亡的劑量范圍。按50％遞增法，設(shè)計(jì)出含數(shù)個(gè)劑量的劑量序列表。根據(jù)估計(jì)，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍，在此范圍內(nèi)，每間隔一個(gè)劑量給一只動(dòng)物，測(cè)出最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用二者之間的劑量給一只動(dòng)物。如果該劑量下動(dòng)物未發(fā)生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍；如果該劑量下動(dòng)物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。五、固定劑量法固定劑量法：是不以死亡作為觀察終點(diǎn)，而是以明顯的毒性體征作為終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。試驗(yàn)選擇5、50、500和2000mg／kg四個(gè)固定劑量進(jìn)行試驗(yàn)，特殊情況下可增加5000ms／kg劑量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首選大鼠，給藥前禁食6—12小時(shí)，給受試物后再禁食3-4小時(shí)。采用一次給藥的方式進(jìn)行如無(wú)資料證明雄性動(dòng)物對(duì)受試藥物更敏感，首先用雌性動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試。根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述四個(gè)劑量中選擇一個(gè)作為初始劑量；若無(wú)有關(guān)資料可作參考時(shí)，可用500ms／kg作為初始劑量進(jìn)行預(yù)試，如無(wú)毒性反應(yīng)，則用2000ms／kg進(jìn)行預(yù)試，此劑量如無(wú)死亡發(fā)生即可結(jié)束預(yù)試。如初始劑量出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，即降低一個(gè)檔次的劑量進(jìn)行預(yù)試，如此時(shí)動(dòng)物存活，就在此兩個(gè)固定劑量之間選擇一個(gè)中間劑量試驗(yàn)。每個(gè)劑量給一只動(dòng)物，預(yù)試一般不超過(guò)5只動(dòng)物。每個(gè)劑量試驗(yàn)之間至少應(yīng)間隔24小時(shí)。給受試物后的觀察期至少7天，如動(dòng)物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。

。在上述預(yù)試的基礎(chǔ)上進(jìn)行正式試驗(yàn)。每個(gè)劑量至少用10只動(dòng)物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，在上述四種劑量中選擇一個(gè)可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進(jìn)行試驗(yàn)。六、急性毒性試驗(yàn)中常用LDso的計(jì)算方法軟件第二節(jié)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

一、概念和目的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)(反復(fù)給藥毒性研究)：是指動(dòng)物反復(fù)多次接觸藥物所引起的毒性反應(yīng)。目的是通過(guò)重復(fù)給藥的動(dòng)物試驗(yàn)表征受試物的毒性作用，預(yù)測(cè)其可能對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)。二、試驗(yàn)內(nèi)容(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)應(yīng)至少在兩種動(dòng)物以上，包括嚙齒類和非嚙齒類，嚙齒類主要是大鼠，非嚙齒類為犬如計(jì)劃生育用藥，應(yīng)選擇猴或其他大動(dòng)物。大鼠體重要求在6—8周齡，試驗(yàn)周期3個(gè)月以上則選5—6周齡。每組試驗(yàn)體重差異不應(yīng)超過(guò)平均體重的20％。犬，如beagle犬一般用4-9月齡，性別要求為雌雄各半。(二)受試藥物和給藥途徑

對(duì)受試藥物應(yīng)注明藥名，批號(hào)，來(lái)源，規(guī)格，純度，理化性質(zhì)，保存條件及配制方法。理想的受試藥物應(yīng)與藥效試驗(yàn)，一般藥理，急毒，致突變，生殖，藥代有相同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所用溶劑應(yīng)注明規(guī)格，來(lái)源，批號(hào)。給藥途徑原則上與臨床用藥途徑一致(三)分組，給藥劑量及給藥周期分組，一般設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組高劑量組原則上要求使動(dòng)物產(chǎn)生明顯或嚴(yán)重毒性反應(yīng)，甚至個(gè)別動(dòng)物死亡，但死亡動(dòng)物數(shù)不應(yīng)超過(guò)20％，目的是為尋找毒性靶器官，毒性反應(yīng)癥狀及臨床搶救措施提供參考依據(jù)。中劑量組要求動(dòng)物產(chǎn)生輕微的或中等的毒性反應(yīng)，一般應(yīng)高于藥效學(xué)試驗(yàn)的高劑量組低劑量組應(yīng)當(dāng)略高于動(dòng)物有效劑量而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，目的是尋找動(dòng)物安全劑量，為臨床劑量的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。根據(jù)不同的臨床用藥周期，決定動(dòng)物長(zhǎng)毒試驗(yàn)的周期，以一個(gè)臨床治療療程為一個(gè)臨床用藥周期，臨床用藥1—3天的藥物，動(dòng)物試驗(yàn)給藥周期為1個(gè)月；臨床用藥1周的藥物，動(dòng)物試驗(yàn)給藥周期為1個(gè)月；臨床用藥4周的藥物，動(dòng)物試驗(yàn)給藥周期為3個(gè)月，臨床用藥3月的藥物，動(dòng)物試驗(yàn)給藥周期為至少半年以上。對(duì)于臨床3個(gè)月內(nèi)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)必須每天給藥一次，但對(duì)于3個(gè)月以上的毒性試驗(yàn)，每周可給藥6次。每天給藥最好是固定時(shí)間。給藥期限為1個(gè)月的長(zhǎng)期毒性研究通?？芍С峙R床療程不超過(guò)2周的藥物進(jìn)行臨床研究和生產(chǎn)。

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臨床療程超過(guò)2周的藥物，可以在臨床前一次性進(jìn)行支持藥物進(jìn)行Ⅲ期臨床研究(生產(chǎn))的長(zhǎng)期毒性研究；也可以根據(jù)具體情況，以不同給藥期限的長(zhǎng)期毒性研究來(lái)分別支持藥物進(jìn)入I期、Ⅱ期或Ⅲ期臨床研究(生產(chǎn))。通過(guò)給藥期限較短的毒性研究獲得的信息，可以為給藥期限較長(zhǎng)的毒性研究設(shè)計(jì)提供給藥劑量、給藥頻率等方面的參考；同時(shí)，臨床研究中獲得的信息有助于給藥期限較長(zhǎng)的動(dòng)物毒性研究方案的設(shè)計(jì)，降低新藥開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于臨床療程超過(guò)2周的藥物，一般1個(gè)月的長(zhǎng)期毒性研究可支持用藥時(shí)間不超過(guò)2周的I期臨床研究；通過(guò)給藥期限不同的長(zhǎng)期毒性研究來(lái)分別支持Ⅱ、Ⅲ期臨床研究。以不同給藥期限的長(zhǎng)期毒性研究來(lái)分別支