第5章 基因組序列詮釋5 +1強(qiáng)伯勤

第五章基因組序列詮釋問(wèn)題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因，研究基因地功能呢？1.尋找基因1.1根據(jù)開(kāi)放讀框預(yù)測(cè)基因⑴起始密碼子ATG第一個(gè)ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則);Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律.Kozak規(guī)則:若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。信號(hào)肽分析軟件(SignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)

把預(yù)測(cè)過(guò)程中證實(shí)含完整mRNA5’端的序列翻譯為蛋白序列;然后用SignalP軟件對(duì)前50個(gè)氨基酸序列(從第一個(gè)ATG對(duì)應(yīng)的甲硫氨酸Met開(kāi)始)進(jìn)行評(píng)估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測(cè)試序列有可能為信號(hào)肽;⑵信號(hào)肽分析⑶終止密碼子

終止密碼子:TAA，TAG，TGAGC%=50%終止密碼子每64bp出現(xiàn)一次；GC%>50%終止密碼子每100－200bp出現(xiàn)一次；由于多數(shù)基因ORF均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是ORF不少于100個(gè)密碼子。⑷3’端的確認(rèn)

3’端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測(cè)試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷。⑸非編碼序列、內(nèi)含子高等真核生物ORF閱讀的復(fù)雜性：基因間存在大量的非編碼序列（人類(lèi)基因組中是70%）絕大多數(shù)基因含有非編碼的內(nèi)含子。高等真核生物多數(shù)外顯子長(zhǎng)度少于100個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少；不能根據(jù)ORF長(zhǎng)度判斷讀框的準(zhǔn)確性。編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異：如人類(lèi)基因中，

丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少蘇氨酸（Thr）密碼子多為ACA,ACC或ACT,而ACG很少⑹密碼子偏愛(ài)性⑺密碼子偏愛(ài)性高等植物207個(gè)基因單子葉植物53個(gè)，6個(gè)單子葉種群，18種氨基酸有16種氨基酸的密碼子搖擺堿基為G+C雙子葉植物154個(gè)，35個(gè)雙子葉種群，只有7種氨基酸的搖擺堿基是G+C，其余均為A+T密碼子偏倚codonbias，原因不明。⑻外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征：如:內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見(jiàn)的順序?yàn)?’－AG↓GTAAGT-3’；3’端又稱受體位（acceptorsite),多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；但是由于邊界序列常有例外，僅適用于一定范圍。⑼上游控制序列幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。

通過(guò)同源性比較來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的5’端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)是真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(TheTRADATProject,EukaryoticPromoterDatabase,EPD.http://www.epd.unil.ch/)。

另外個(gè)別生物基因組的特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游都有CpG島。

⑽內(nèi)含子和外顯子序列差異內(nèi)含子受選擇壓力小，突變多。由于堿基C到A，內(nèi)含子A/T比例高內(nèi)含子A/T比例高，所以終止密碼子出現(xiàn)的頻率高。

⑾軟件預(yù)測(cè)采用NCBI的ORF預(yù)測(cè)軟件(ORFfinder:/gorf/orfig.cgi)判斷ORF的可能范圍?；蜃⑨屲浖礼enscan——重于信號(hào)指令：起始密碼、終止密碼、剪接受體位和供體位序列等FgeneSH——重于內(nèi)容指令：密碼子使用偏好、內(nèi)含子外顯子的差異等TWINSCAN和SGP2——根據(jù)相似性和一致性基因注釋軟件缺點(diǎn)外顯子注釋的準(zhǔn)確率<80%。誤拼和誤拆錯(cuò)誤較多。容易忽略結(jié)構(gòu)較小的基因，特別是基因內(nèi)基因。線蟲(chóng)基因的注釋19477個(gè)軟件預(yù)測(cè)11984個(gè)克隆驗(yàn)證，未能預(yù)測(cè)到的cDNA和EST為4365個(gè)1.2同源查詢途徑

通過(guò)已存入數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因順序與待查的基因組序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。

相似性有如下幾種情況：

ADNA序列某些片段完全相同；B開(kāi)放讀碼框（ORF）排列類(lèi)似，如有長(zhǎng)外顯子；C開(kāi)放讀碼框翻譯成氨基酸序列的相似性；D模擬多肽高級(jí)結(jié)構(gòu)相似同源基因：氨基酸的一致性和相似性>25%同源性：homology起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的序列，分布在不同物種間的同源基因，只有是與非的區(qū)別。一致性：identity同源DNA序列的同一堿基位置上相同的堿基成員，或者蛋白質(zhì)中同一氨基酸位置相同的氨基酸成員的比例，用%表示。相似性：similarity同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。比較氨基酸和基因的同源性？分子雜交可確定DNA片段是否含有表達(dá)順序Northernblot：指將待測(cè)DNA樣品標(biāo)記后與RNA雜交，以判斷RNA中是否含有DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但在操作中存在一些問(wèn)題1.3試驗(yàn)確認(rèn)基因1977年J.C.Alwin首創(chuàng)Northernblotting

問(wèn)題解決方案A某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接或該基因?yàn)槟骋欢嗷蚣易宓某蓡T時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)雜交帶設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)區(qū)分心肌特異性蛋白問(wèn)題解決方案B基因的表達(dá)具有組織特異性及發(fā)育階段的差別，而選擇的RNA樣品中不一定含有該基因產(chǎn)物盡可能多地收集各種不同發(fā)育時(shí)期及不同組織器官的RNA問(wèn)題解決方案C某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取適當(dāng)提高RNA上樣量，或先以已知的DNA序列設(shè)計(jì)引物從mRNA中擴(kuò)增基因產(chǎn)物C基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問(wèn)題擬Northern雜交——根據(jù)已知的DNA順序設(shè)計(jì)引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。動(dòng)物園雜交——根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。DNA順序中基因位置的確定cDNA測(cè)序受兩個(gè)方面的影響：一是相關(guān)cDNA在cDNA文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率；二是cDNA的完整性如何獲取基因全長(zhǎng)cDNA序列？AcDNA文庫(kù)構(gòu)建BRACE技術(shù)干擾cDNA篩選基因的因素：目標(biāo)cDNA所占比例很低分成亞群進(jìn)行篩選cDNA均一化

影響cDNA測(cè)序的因素與mRNA的反轉(zhuǎn)錄有關(guān)cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)5’RACE(CLONTECH)3’RACE(CLONTECH)確定DNA順序中基因的位置A通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)序、對(duì)比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B通過(guò)物種已建立遺傳圖和物理圖來(lái)確定基因的位置；利用計(jì)算機(jī)分析基因功能2、基因功能的預(yù)測(cè)2.1同源性確定基因功能2.2同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用2.1同源性確定基因功能

種間同源基因或直系基因（orthologousgene）：指不同物種之間的同源基因，它們來(lái)自物種分化以前的共同祖先

種內(nèi)同源基因或平行基因（paralogousgene）同一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因家族的不同成員同源基因一般不會(huì)有完全一致的核苷酸序列，因?yàn)椴煌幕蚧虿煌纳锒紩?huì)獨(dú)立地發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷酸位置是相同的

同源性分析可以給出整個(gè)基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)信息2.2同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用酵母基因組大約含有6000個(gè)基因30％是通過(guò)傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的另外70％是用同源性分析獲得3.1基因失活在基因功能分析的作用3.2基因的超表達(dá)用于功能檢測(cè)3、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能3.1.1基因剔除(knock-out)最簡(jiǎn)便的基因失活的方法.主要原理:在一段無(wú)關(guān)DNA片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的順序，將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞，由于同源片段之間的重組，可使無(wú)關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中。為了便于篩選，用于取代的外源DNA中含有報(bào)告基因。3.1基因失活在基因功能分析的作用tk胸苷激酶標(biāo)記基因←gangcyclovirneor新霉素抗性基因→G4183.1.2反義RNA

反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼，可與正義RNA(senseRNA)或DNA編碼順序結(jié)合，干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄，加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控基因的表達(dá)。構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體:將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物→獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系→分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異→判別目的基因的功能正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體反義RNA作用機(jī)理：

A干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。B與mRNA的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無(wú)法啟動(dòng)。C反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板，轉(zhuǎn)錄終止。3.1.3RNA干涉

RNAi是通過(guò)