第五章各類中藥分析

第五章中藥制劑中各類化學(xué)成分分析

第一節(jié)生物堿類成分分析生物堿是來(lái)源于生物界的一類含氮有機(jī)化合物(氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和B族維生素等除外)，大多具有顯著的生物活性。1.2結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì)結(jié)構(gòu)特性大多含有C，H，N，O組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)類型較多氮原子有多種形式有羧基,酚羥基等酸性官能團(tuán)及酯鍵取代1.2結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì)物理性質(zhì)多為結(jié)晶型固體，少數(shù)為液體。一般生物堿為白色或無(wú)色，但結(jié)構(gòu)中具有較長(zhǎng)共軛體系，并有助色團(tuán)的可顯不同顏色。旋光性與生理活性相關(guān)，左旋體比右旋體生理活性強(qiáng)。1.2結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì)生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液硅鎢酸磷鎢酸磷鉬酸(BH+)4[Si(W3O10)4](淡黃色或灰白色)3BHPO4·12WO32H2O（白色至褐色）3BH3PO412MoO3·2H2O（白色至黃褐色,加氨水轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色）沉淀反應(yīng)§1生物堿類成分分析呈色反應(yīng)堿性生物堿堿性強(qiáng)弱是中藥制劑分析時(shí)供試品溶液制備、某些分析方法建立及條件選擇的依據(jù)。+酸性染料有色配合物一定pH值

三、定性鑒別沉淀反應(yīng)是生物堿最常用的鑒別方法。有些成分也可與試劑生成沉淀而造成假陽(yáng)性結(jié)果。（一）化學(xué)反應(yīng)法（二）色譜法薄層色譜鑒別吸附劑：氧化鋁、硅膠展開劑：氯仿、苯等顯色劑：改良碘化鉍鉀試劑，碘蒸氣等溶劑提取濃縮凈化層析生物堿顯色劑顏色反應(yīng)或熒光供試品生物堿點(diǎn)樣+

如用硅膠為吸附劑時(shí),一般應(yīng)用堿性系統(tǒng)展開劑較多,或使生物堿的薄層分離在堿性環(huán)境下進(jìn)行。（二）色譜法2、高效液相

在恒定的高效液相色譜條件下，各種生物堿都具有一定的保留時(shí)間，可作為定性鑒別的參數(shù)。一般要求取得兩個(gè)色譜系統(tǒng)的保留時(shí)間，或應(yīng)用二級(jí)管陣列檢測(cè)器作出鑒定。四、含量測(cè)定（一）總生物堿含量測(cè)定化學(xué)分析法分光光度法

§1生物堿類成分分析

酸堿滴定法：

a.游離生物堿不溶于水，可先將生物堿溶于過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中,再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴

b.生物堿鹽在水或乙醇介質(zhì)中，用強(qiáng)酸溶液滴定。一般使其溶于90％乙醇溶液中，可用標(biāo)準(zhǔn)酸乙醇液滴定，用酚酞作指示劑。

重量分析法

將生物堿從中藥制劑中提取，用適宜的方法使其生成沉淀，干燥后直接稱重。優(yōu)點(diǎn)：計(jì)算簡(jiǎn)便，不用換算因數(shù)，不必考慮生物堿的分子量。缺點(diǎn)：揮發(fā)性生物堿，蒸發(fā)提取溶劑或加熱、干燥時(shí)能分解破壞以及加堿使生物堿游離時(shí)可發(fā)生水解的生物堿不可用此法。取樣量大，操作時(shí)易乳化，費(fèi)時(shí)。（1）酸性染料比色法本法測(cè)定的關(guān)鍵在于：介質(zhì)的pH值，氫鍵。（2）雷氏鹽比色法生物堿與雷氏鹽生成沉淀后，將沉淀分離，溶于丙酮，于520～526nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定吸收度，換算生物堿的含量。生物堿的雷氏鹽沉淀的丙酮溶液所呈現(xiàn)的吸收特征，是由于分子結(jié)構(gòu)中的硫代氰酸鉻銨部分，而不是結(jié)合的生物堿部分，其吸收值與樣品或溶劑無(wú)關(guān)。

硫代氰酸鉻銨在丙酮中的克分子吸收系數(shù)為106.5(單鹽)或213.0(雙鹽)。故可根據(jù)其吸收值A(chǔ)按下式直接測(cè)得樣品重：

W=（A/ε）×M×V/1000

本方法可不需要標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，但需注意生物堿生成單鹽或雙鹽，并要注意樣品的凈化。（2）雷氏鹽比色法

1、薄層色譜法薄層色譜技術(shù)在生物堿類成分分離和測(cè)定須結(jié)合生物堿的通性選擇合適的提取溶劑制成供試品溶液，需要采用化學(xué)方法提取和純化，常用液-液萃取或液-固萃取，或結(jié)合生物堿的特性進(jìn)行純化。常使用堿性展開劑或在堿性氣氛中展開。（二）單體生物堿含量測(cè)定2、高效液相色譜生物堿類成分進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，可采用正相、反相和離子對(duì)色譜，其中以反相高效液相色譜應(yīng)用較多。需要克服游離硅醇基的影響。流動(dòng)相方面的改進(jìn)：

a.加入硅醇基抑制劑，最常用的硅醇基抑制劑是三乙胺;b.在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑;c.在流動(dòng)相中加入季銨鹽試劑，例如在水-甲醇流動(dòng)相中加入0.01mol／L的溴化四甲基胺。固定相方面的改進(jìn)：封尾技術(shù)：

鍵和反應(yīng)結(jié)束后，用三甲基硅氯烷等進(jìn)行后續(xù)處理，盡量減少參與羥基，增加單體覆蓋度。2、高效液相色譜

§1生物堿類成分分析高效液相色譜

鍵合相(配體)：C18殘留硅羥基端基封口基團(tuán)硅膠基質(zhì)§2黃酮類成分分析金絲桃黃芩

黃酮類化合物為自然界廣泛存在的一大類化合物，多具有顏色，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成甙，一部份以游離形式存在?！?黃酮類成分分析§2黃酮類成分分析理化性質(zhì)物理性狀（存在的形態(tài)，顏色，揮發(fā)性，光學(xué)活性）溶解性酸堿性酸性：與酚羥基的數(shù)目和位置有關(guān)

7,4‘-二羥基>7-或4‘-羥基>一般酚>5-羥基游離甙元—易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等黃酮甙—易溶于水、甲醇、乙醇§2黃酮類成分分析理化性質(zhì)顯色反應(yīng)還原反應(yīng)（鹽酸鎂粉反應(yīng)）金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)（鋁、鉛、鋯、鎂鹽）紫外光譜特征I帶(300-400nm)→B環(huán)桂皮?；鵌I帶(240-285nm)→A環(huán)苯甲?；?黃酮類成分分析1.3.1化學(xué)顯色反應(yīng)鹽酸-鎂粉反應(yīng)

鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯色反應(yīng)的機(jī)理是黃酮類成分經(jīng)還原反應(yīng)后生成花色甙元及其二聚物現(xiàn)在認(rèn)為是陽(yáng)碳離子。取樣品液5～10mL，加入數(shù)滴鹽酸，然后加入少許鎂粉，如果有黃酮、黃酮醇或其二氫化合物存在，數(shù)分鐘后則可產(chǎn)生橙色或紅色。必要時(shí)，需作空白試驗(yàn)。

§2黃酮類成分分析1.3.1化學(xué)顯色反應(yīng)與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)

黃酮類成分能與金屬離子如Al3+，Zr4+等產(chǎn)生絡(luò)合作用，產(chǎn)生熒光或顏色加深等。配合作用的條件是黃酮類成分必須具備下述條件之一者，即5-羥基(a)、3-羥基(b)或鄰二酚羥基(c)，(a)、(b)都是羥基與4位羰基共同與金屬離子形成絡(luò)合物的。

§2黃酮類成分分析2.3定性鑒別2.3.2薄層色譜鑒別硅膠--分離弱極性黃酮展開系統(tǒng)：甲苯-甲酸乙酯-甲酸，氯仿-甲醇聚酰胺--分離含游離酚羥基的黃酮及其苷展開系統(tǒng)：醋酸，醋酸乙酯-甲酸-水等纖維素--分離多糖苷混合物展開系統(tǒng)：正丁醇-乙酸-水，甲酸，乙酸

§2黃酮類成分分析

硅膠分離黃酮成分遵循正相色譜層析規(guī)律，化合物極性越強(qiáng)，所需溶劑的極性越大。其Rf值順序如下：RCH3>RH>ROCH3>R-O-糖>ROH硅膠薄層色譜

§2黃酮類成分分析

聚酰胺薄層色譜

聚酰胺薄層色譜用于分離含游離酚羥基的黃酮甙與甙元較好。由于各種黃酮類成分取代基團(tuán)的性質(zhì)、多少和位置的不同，與聚酰胺形成氫鍵的能力有所差異而得到分離。

§2黃酮類成分分析2.4含量測(cè)定

2.4.1總黃酮類成分的測(cè)定黃酮類化合物具有特定的紫外吸收Ⅰ帶在300～400nm,Ⅱ帶在240～285nm，提純后可直接測(cè)定總黃酮時(shí)常用蘆丁作對(duì)照品。復(fù)雜體系中與金屬鹽類試劑生成配合物，常用的是氯鹽反應(yīng)，試劑為三氯化鋁和硝酸鋁。

§2黃酮類成分分析2.4含量測(cè)定

2.4.2單體黃酮成分的含量測(cè)定

薄層色譜法薄層色譜法是測(cè)定中藥制劑中單體黃酮類成分的關(guān)鍵是分離。樣品經(jīng)有機(jī)溶劑或水提取后，可用硅膠、纖維素或聚酰胺進(jìn)行層析，以達(dá)到分離的目的。層析后可TLC-比色法測(cè)定；也可以用薄層掃描儀直接測(cè)定。

§2黃酮類成分分析2.4含量測(cè)定

2.4.2單體黃酮成分的含量測(cè)定高效液相色譜法黃酮類成分的HPLC：

a.無(wú)羥基的黃酮類化合物或乙酰化黃酮類化合物，固定相為硅膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要相對(duì)小一點(diǎn)。

b.乙酰化黃酮、有一個(gè)羥基的黃酮類成分，采用-CN鍵合相色譜，流動(dòng)相為乙烷-氯仿。

§2黃酮類成分分析2.4含量測(cè)定

2.4.2單體黃酮成分的含量測(cè)定高效液相色譜法黃酮類成分的HPLC：

c.含有2個(gè)以上羥基的黃酮類成分可選用-NH2鍵合相，流動(dòng)相可選用二氧六環(huán)-二氯甲烷(1∶9)。黃酮類成分的Rp-HPLC：

大多用C18鍵合相，流動(dòng)相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸緩沖液)及乙腈-水。

§3三萜皂甙類成分分析3.1概述3.2理化性質(zhì)物理性狀（存在的形態(tài)，表面活性，吸濕性）溶解性紫外光譜特征大多無(wú)明顯的紫外吸收或僅在200nm附近有末端吸收皂甙元—能溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿等皂甙—可溶于水，易溶于熱水、含水稀醇等甘草酸

§3三萜皂甙類成分分析3.3皂甙類成分的定性分析3.3.1泡沫反應(yīng)取中藥材粉末約1g,加水10ml,煮沸10分鐘后過(guò)濾,將濾液于試管內(nèi)強(qiáng)烈振搖,如產(chǎn)生持久性泡沫(15分鐘以上)即為陽(yáng)性反應(yīng).所產(chǎn)生的泡沫多少與pH有關(guān),取2支試管,一管加入0.1mol/L鹽酸液5ml，另一管加入0.1mol/L氫氧化鈉液5ml，再各加入中藥水溶液，使酸管的pH為1，堿管pH為13，強(qiáng)烈振搖，如兩管所形成的泡沫高度相同，則中藥中含三萜皂甙，如堿管泡沫較酸管泡沫高數(shù)倍，則中藥中含甾體皂甙。

§3三萜皂甙類成分分析3.3.2薄層色譜鑒別吸附劑：硅膠、氧化鋁、硅藻土展開劑：三萜皂甙—氯仿-甲醇-水、正丁醇-醋酸乙酯-水等極性較大的體系三萜皂甙元--以苯、氯仿、己烷等為主要組分顯色劑三氯醋酸、50%及10%硫酸乙醇液、磷鉬酸、濃硫酸-醋酸酐、碘蒸氣等樣品：1-2．生曬參；3-5．紅參；6-9．朝鮮紅參；10-12．西洋參(進(jìn)口)；13-14．西洋參(國(guó)產(chǎn))；15．三七；16．人參皂甙對(duì)照品Rb1(S1)，Rb2(S2)，Rc(S3)，Re(S4)，Rd(S5),Rg1(S6)，Rf(S7)，F(xiàn)ll(S8)。

§3三萜皂甙類成分分析3.4皂甙類成分的定量分析

皂甙類成分的定量分析可分為總皂苷測(cè)定皂苷元測(cè)定單體皂苷測(cè)定

§3三萜皂甙類成分分析總皂甙的含量測(cè)定一般需用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛。缂状?80％～95％)、乙醇等，提取后經(jīng)分離（如水飽和的正丁醇萃取，大孔吸附樹脂經(jīng)處理后溶劑洗脫）得到總皂甙成分，再根據(jù)皂甙類化合物的各自特征來(lái)選擇含量測(cè)定方法。最常用的方法是比色法。

§3三萜皂甙類成分分析3.4.1總皂苷的含量測(cè)定比色法常利用皂甙能與某些試劑反應(yīng)后產(chǎn)生顏色，然后于可見(jiàn)光區(qū)進(jìn)行比色測(cè)定.§4醌類成分分析4.1概述4.2理化性質(zhì)物理性狀（存在的形態(tài)，升華性，光不穩(wěn)定性）溶解性酸堿性酚羥基→酸性游離—溶于乙醇、苯、乙醚、氯仿等醌甙—可溶于熱水，易溶于甲醇、乙醇大黃素§4醌類成分分析4.2理化性質(zhì)顯色反應(yīng)羥基蒽醌+堿→橙，紅，紫紅，藍(lán)α-酚羥基或鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)+Pb2+/Mg2+→配合物+對(duì)亞硝基二甲基苯胺→紫，綠，藍(lán)，灰§4醌類成分分析4.3定性鑒別

4.3.1顯色反應(yīng)§4醌類成分分析4.3定性鑒別

4.3.2升華法游離的蒽醌及其他醌類衍生物多具有升華性。中藥制劑中如含有這類成分量較大，可采用升華法得到升華物，可見(jiàn)光下觀察或加堿性試液顯色定性?！?醌類成分分析4.3定性鑒別4.3.3薄層鑒別吸附劑：硅膠展開劑：含甲醇或水的混合溶劑系統(tǒng)→分離甙和甙元不含甲醇或水的混合溶劑系統(tǒng)→分離甙元顯色：堿性試劑，醋酸鎂甲醇液、氨熏§4醌類成分分析4.4含量測(cè)定游離蒽醌的測(cè)定弱極性溶劑提取后，加堿比色

結(jié)合蒽醌的測(cè)定極性溶劑提取，水解測(cè)甙元先酸水解后，非極性溶劑提取甙元后測(cè)定醌類單體成分含量測(cè)定薄層色譜法高效液相色譜

4.4.2萘醌，菲醌類成分含量測(cè)定

萘醌類見(jiàn)于紫草，地下明珠等制劑菲醌類成分多見(jiàn)于以丹參為主藥的各類制劑中重量法、分光光度法常用于測(cè)定萘醌、菲醌類總成分含量薄層色譜法、高效液相色譜法常用于測(cè)定單體成分含量§4醌類成分分析

§4醌類成分分析牛黃解毒片中游離蒽醌和總蒽醌的測(cè)定對(duì)照品溶液測(cè)定：

以1，8-二羥基蒽醌為對(duì)照品，精密稱取10mg于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度（100μg/mL）。取1mL對(duì)照品液于10mL量瓶中，在水浴上蒸干，加5%氫氧化鈉-2%氫氧化銨混合堿溶解并稀釋至刻度，放置1小時(shí)，以5%氫氧化鈉-2%氫氧化銨混合堿液為空白，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定?！?醌類成分分析樣品測(cè)定：⑴游離蒽醌的測(cè)定：取牛黃解毒片10片，刮去糖衣，精密稱定重量，研細(xì)。稱取一片重，置于具塞三角瓶中，精密加入氯仿100mL，稱重，水浴上回流4小時(shí)，取下，加塞，放冷，稱重，用氯仿補(bǔ)充至原重量，濾過(guò)，吸取濾液50mL于分液漏斗中，用蒸餾水20mL洗滌數(shù)次，至水層無(wú)色，棄去水液。氯仿層用5%氫氧化鈉-2%氫氧化銨混合堿液振搖萃取數(shù)次，直至混合堿液無(wú)色，合并堿液，用20mL氯仿洗滌數(shù)次，至氯仿層無(wú)色，棄去氯仿層。將混合堿液在水浴上加熱數(shù)分鐘至氯仿?lián)]盡，冷卻，移入100mL量瓶中，并稀釋至刻度，放置1小時(shí)，以5%氫氧化鈉-2%氫氧化銨混合堿液為空白，在510nm處測(cè)定，計(jì)算游離蒽醌的含量（相當(dāng)于1，8-二羥基蒽醌含量）。§4醌類成分分析⑵總蒽醌的測(cè)定：精密稱取游離蒽醌項(xiàng)下的牛黃解毒片粉一片置于150mL燒瓶中，加2.5mol/L硫酸30mL直火回流4小時(shí)，放冷，加入氯仿20mL，水浴回流0.5小時(shí)，放冷，吸出氯仿液，再加氯仿，反復(fù)操作至氯仿無(wú)色為止。合并氯仿層液，用蒸餾水洗滌數(shù)次，至水層無(wú)色，棄去水液。氯仿液用5%氫氧化鈉-2%氫氧化銨混合堿液振搖萃取數(shù)次，至堿液無(wú)色，合并，用20mL氯仿洗滌數(shù)次，至氯仿層無(wú)色，棄去氯仿液。將堿液置水浴上加熱至氯仿?lián)]盡，冷卻，移入50mL量瓶中，用混合堿液稀釋至刻度，放置1小時(shí)，以5%氫氧化鈉-2%氫氧化銨液為空白，在510nm處測(cè)定，計(jì)算游離蒽醌的含量（相當(dāng)于1，8-二羥基蒽醌含量）。§4醌類成分分析⑶結(jié)合蒽醌的計(jì)算：每片含結(jié)合蒽醌量=每片含總蒽醌量—每片含游離蒽醌量?！?揮發(fā)性成分分析5.1概述

揮發(fā)性成分指中藥中一類具有芳香氣并易揮發(fā)的成分，化學(xué)組成復(fù)雜，主要包括揮發(fā)油類成分和其他分。分子量較小，易揮發(fā)的化合物。