第三章基因工程制藥2011-101

第三章基因工程制藥傳統(tǒng)制藥存在的問題A.材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法付諸應(yīng)用;B.從動物臟器中提取出來,也因造價太高,或因來源困難而供不應(yīng)求;C.由于免疫抗原等緣故,使它們在使用上受到限制如應(yīng)用傳統(tǒng)的技術(shù)方法提取生長激素抑制素1毫克需要用十萬只羊的下丘腦，所要耗費的資金大約等于經(jīng)由人造衛(wèi)星從月球上搬回一公斤石頭。而用基因工程方法生產(chǎn)同樣激素只需十公升大腸桿菌培養(yǎng)液，其價格大約為每毫克0.3美元。基因工程制藥的優(yōu)點:a.可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì),為臨床使用提供有效的保障;b.利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn),挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì);c.可以通過對上述物質(zhì)的生理生化和結(jié)構(gòu)進行研究,從而擴大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍;d.上述活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處,可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造;e.利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物,擴大藥物篩選來源.“863”高技術(shù)計劃在生物技術(shù)領(lǐng)域研究的三個主題之一是：新型藥物、疫苗和基因治療，重點是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，開發(fā)化學合成法難以生產(chǎn)的藥品。王大珩中國科學院院士，中國工程院院士，我國應(yīng)用光學及光學工程的主要奠基人之一。王淦昌中國科學院院士、著名高能物理學家。楊嘉墀中國科學院院士，著名空間自動控制專家。

陳芳允中國科學院院士，著名電子學家?！笆濉逼陂g，863計劃選擇了信息技術(shù)、生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)、新材料、先進制造與自動化技術(shù)、能源技術(shù)、資源環(huán)境技術(shù)等6個高技術(shù)領(lǐng)域。

國家

發(fā)展策略

投入資金

臨床試驗

上市品種

產(chǎn)值

美國

支持基礎(chǔ)，創(chuàng)新，主導(dǎo)領(lǐng)先水平100億US$/年350[2001（1-19）]

110[2001]200億US$/年

日本

合作，實用化，信息化兩千億日元/年

50種以上

50五千億日元/年德國

創(chuàng)新，轉(zhuǎn)讓，加大投入

100

68[2001(12)]`

中國重視，優(yōu)先、優(yōu)惠

20余種

2030億人民幣基因工程藥物的研究開發(fā)狀況主要國家基因制藥產(chǎn)業(yè)化概況

名稱

適應(yīng)癥

生產(chǎn)廠rhuIFNα1b（外用）rhuIFNα1b

病毒性角膜炎

乙肝、丙肝長春生研所深圳科興、上海生研所、北京三元基因rhuIFNα2arhuIFNα2a（酵母）

乙肝、丙肝皰疹等乙肝、丙肝長春生研所、長生藥業(yè)、三生藥業(yè)、新大洲藥業(yè)、遼寧衛(wèi)星生物上海萬興生物rhuIFNα2b

乙肝、丙肝白血病等安科、汗生、華新、鼎力、策遠、華立達、英特龍、里西哈爾rhuIFNα2a（栓劑）rhuIFNα2b（凝膠劑）

婦科病皰疹等武漢天奧藥廠合肥科大兆峰藥廠rhuIFNγ

類風濕上海生研所、克隆、麗珠rhuEGF（外用）EGF衍生物

燒傷、創(chuàng)傷大江、長生藥業(yè)、四環(huán)深圳華生元rhuIL-2

癌癥輔助治療沈陽三生、長生藥業(yè)、金泰、長春生研所、瑞德制藥、四環(huán)、金絲利、深圳科興、華新、康利制藥、白鷺圓rhuIL-2125Ser

癌癥輔助治療上海華晨rhuG-CSF

刺激產(chǎn)生白細胞廈門特寶、杭州九源、白鷺圓、、長春金賽、蘇州中凱、三維、北海方舟、山東科興、新鵬、格蘭百克、齊魯制藥、成都蓉生、里亞哈爾、華北制藥、泉城、九九艷陽、汗進制藥rhuGM-CSF

刺激產(chǎn)生白細胞骨髓移植廈門特寶、華北制藥、北醫(yī)聯(lián)合、里亞哈爾、海南華康、順德南方、上海海濟、金賽、山東醫(yī)生所、鑫金炎、淮南福壽、華晨、上海生化、上海華新rhuEPO

產(chǎn)生紅細胞三生制藥、華欣藥業(yè)、克隆、山東科興、成都地奧、阿華、四環(huán)生物rhuGH

矮小病金賽、安科、恒通、醫(yī)進、聯(lián)合賽爾

bFGF（外用）

創(chuàng)傷、燒傷珠海東大、長生藥業(yè)

rSK

溶血栓（心梗）復(fù)興實業(yè)、金泰IL-8單抗乳膏劑

銀屑病東莞宏遠逸士公司

人胰島素

糖尿病通化東寶、醫(yī)進、科興

乙肝疫苗

預(yù)防乙肝深圳華泰、北京生研所、華北藥廠

痢疾疫苗

預(yù)防痢疾蘭州生研所、軍科院第一節(jié)基因工程制藥基本環(huán)節(jié)獲得目的基因組建DNA重組體培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物的分離純化除菌過濾構(gòu)建基因工程菌或細胞半成品檢定成品檢定包裝上游下游基因工程藥物的上游技術(shù)：1、基因克隆載體:質(zhì)粒載體，2、重組DNA技術(shù)的有關(guān)工具酶及其應(yīng)用3、核酸制備技術(shù)：制備純凈、高質(zhì)量的載體DNA和待克隆的核酸，才能有效地進行后續(xù)的酶切、反轉(zhuǎn)錄、連接等分子克隆操作。

1）用堿抽提法分離質(zhì)粒DNA原理：細胞pH12.0-12.6線狀DNA變性，cccDNA不變性，加酸恢復(fù)pH到中性，變性的染色體DNA交織成網(wǎng)而沉淀，上清用酚處理使蛋白變性，用醇沉淀質(zhì)粒DNA。

A）質(zhì)粒DNA的小量制備B）質(zhì)粒DNA的大量制備基因工程操作中最常用的工具酶一、基因工程菌的構(gòu)建與篩選核酸限制性內(nèi)切酶DNA連接酶聚合酶1.核酸限制性內(nèi)切酶:指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。

限制內(nèi)切酶與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-ModificationSystem)。命名：第一個字母（大寫,斜體）：該酶來源的微生物屬名；第二、三個字母（小寫、斜體）：微生物種名；若該微生物有不同的變種和品系，再加上該變種和品系的第一個字母（大寫）若從同一微生物發(fā)現(xiàn)多種限制性內(nèi)切酶，則依照發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。分類Ⅰ型限制性內(nèi)切酶Ⅱ型限制性內(nèi)切酶Ⅲ

型限制性內(nèi)切酶Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識別并特異切割DNA分子。識別長度為4-8個核苷酸的特異序列；許多識別序列具回文結(jié)構(gòu)，如HindⅢ的識別序列：

5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割產(chǎn)生末端有粘端

(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)

和平端

(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)異源同工酶(isoschizomer)

來源不同但能識別和切割同一位點的酶。又稱同裂酶。如：BamHI

(G↓GATCC)和BstI

(G↓GATCC)同尾酶（isocaudamer)

識別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的影響因素①DNA模板的純度②DNA的甲基化程度③酶切反應(yīng)溫度④DNA的分子結(jié)構(gòu)⑤緩沖液2DNA連接酶兩類:

◆T4噬菌體DNA連接酶◆大腸桿菌DNA連接酶3聚合酶（DNApolymerase）分為DNA聚合酶和RNA聚合酶，能夠分別催化DNA和RNA的體外合成。目前基因工程中應(yīng)用較多的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，Klenow酶，T4噬菌體DNA聚合酶，T7噬菌體DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶及反轉(zhuǎn)錄酶。DNA聚合酶Ⅰ5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。Klenow聚合酶5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性，無5`→3`外切酶活性。TaqDNA聚合酶5`→3`聚合活性。反轉(zhuǎn)錄酶催化以RNA作為模板的DNA合成反應(yīng)。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶酶特點：不需模板，四種DNTP任意一種可作前體物。2.載體概念：凡來源于質(zhì)?；蚴删w的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因DNA并具有運載外源DNA導(dǎo)入宿主細胞能力的片段。載體的功能及特征理想的基因工程載體一般至少有以下幾點要求：能在宿主細胞中復(fù)制繁殖，而且最好要有較高的自主復(fù)制能力。容易進入宿主細胞，而且進入效率越高越好。容易插入目的基因，插入后不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復(fù)制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點。容易從宿主細胞中分離純化出來。有容易被識別篩選的標志，當其進入宿主細胞、或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來。這才介于克隆操作。

載體(Vector)宿主(Host)

質(zhì)粒(Plasmids)細菌(Bacteria)植物(Plants)酵母(Yeats)

噬菌體(Phages)細菌(Bacteria)病毒(Viruses)動物細胞(AnimalCells)基因工程常用載體

質(zhì)粒（Plasmid）

是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,大小約為數(shù)千堿基對。常有1~3個抗藥性基因，以利于篩選。質(zhì)粒構(gòu)型質(zhì)粒的特性質(zhì)粒作為載體的優(yōu)缺點用于克隆表達的質(zhì)粒載體涉及要素常用的質(zhì)?？寺≥d體表達載體表達載體具備的條件分類原核表達載體1.化學合成法2.PCR法3.基因文庫法4.cDNA文庫法3.目的基因的常用制備方法1.必須已知目的基因排列順序2.不能合成太長的肽3.易造成中性突變4.成本較高1)化學合成法

方法：合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。2).PCR法：可以在體外特異性地擴增目的基因片段，并可以在設(shè)計引物時引入合適的酶切位點和標簽結(jié)構(gòu)，是目前實驗室常用的目的基因制備法。3).基因文庫法：將生物體全部基因組通過酶切分成不同DNA片斷，與載體連接，構(gòu)成重組子，轉(zhuǎn)化宿主細胞，從而形成生物體全部基因組DNA片斷的克隆。4).cDNA文庫法

cDNA是指與mRNA互補的DNA。cDNA文庫法是指提取生物體總mRNA，并以mRNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，將全部的cDNA都克隆至宿主細胞而構(gòu)建cDNA文庫。4.載體DNA與目的基因的連接1.黏性末端DNA片斷與載體DNA連接：用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補配對后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。2.平頭末端DNA片斷與載體DNA連接：

某些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來。缺點：效率低，需高濃度的DNA和大量的T4DNA連接酶,所用ATP及T4DNA連接酶的濃度比粘性末端連接要高（大于2.5倍）3.人工接頭法

合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。4.同源多聚尾連接法5.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：DNA片段之間的連接方式，目的基因與載體的濃度和比例，連接溫度，時間，連接酶的活性及緩沖體系。1）重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌①轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入宿主細胞的過程。主要步驟：先制備感受態(tài)細胞，加入重組DNA，分別用不含和含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，最后得到轉(zhuǎn)化子。5.重組DNA導(dǎo)入宿主細胞②轉(zhuǎn)染：用λDNA或粘性質(zhì)粒為載體與目的基因構(gòu)成重組DNA，經(jīng)外殼包裝成具感染能力的λ噬菌體注入大腸桿菌進而擴增。2）.重組DNA導(dǎo)入酵母常用方法：電轉(zhuǎn)化法、化學轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法3）.重組DNA導(dǎo)入鏈霉菌常用方法：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法及電穿孔轉(zhuǎn)化法4）.重組DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞常用方法：物理法、化學法、生物法物理法：顯微注射法、電穿孔法化學法：DNA－磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法、DEAE－葡萄糖轉(zhuǎn)染法；生物法：病毒感染法、融合法磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。

該方法簡單，可以進行共轉(zhuǎn)化，但不太適合懸浮細胞的轉(zhuǎn)染。

電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。

該方法轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低，適合于懸浮細胞。

6.重組子的篩選與鑒定篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法

1）載體遺傳標記2）核酸分子雜交法3）DNA序列測定法4）限制酶切圖譜篩選5）目的基因表達產(chǎn)物測定法抗性篩選藍－白篩選營養(yǎng)缺陷篩選噬菌斑篩選抗性篩選法基本原理1）載體遺傳標記互補篩選法營養(yǎng)缺陷性篩選法噬菌斑篩選法2.核酸分子雜交法菌落原位雜交制備與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列，根據(jù)核酸雜交原理，探針序列特異性雜交目的基因，并通過放射性或熒光基團進行定位檢測。DNA/RNA印跡分析4.DNA序列測定法3.限制性內(nèi)切酶圖譜法目的篩選重組子與非重組子7.原核細胞表達的特點及選擇

因為大腸桿菌的分子遺傳學研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。1.外源基因表達的調(diào)控原件：啟動子，核糖體結(jié)合位點和終止子。2.外源基因在大腸桿菌的表達形式：胞內(nèi)表達和分泌表達。3.大腸桿菌中外源基因表達效率的影響因素：外源基因密碼子的使用，mRNA結(jié)構(gòu)，表達載體的構(gòu)建和外源蛋白穩(wěn)定性。

2.外源基因在大腸桿菌的表達形式：胞內(nèi)表達：分泌表達：在N端加上能夠跨膜的信號肽序列。這對重組蛋白的折疊可能有一定好處；由于跨膜是逐個進行的，蛋白間的交聯(lián)機會較少；周質(zhì)中的蛋白酶活性比胞質(zhì)低；周質(zhì)蛋白僅占菌體總蛋白的4%，使之易于純化。融合型表達的優(yōu)缺點：優(yōu)點：1．穩(wěn)定性強2．比單純分泌表達產(chǎn)量高缺點：1．需將融合蛋白兩者分開，對酶切試劑和工藝的要求高2．可能面臨體外復(fù)性問題分泌型表達的優(yōu)缺點優(yōu)點：1可溶性表達2可能接近天然構(gòu)象3Met可被切除缺點：1表達量低2純化較困難3面臨復(fù)性問題3.大腸桿菌中外源基因表達效率的影響因素：

外源基因密碼子的使用，mRNA結(jié)構(gòu)，表達載體的構(gòu)建，外源蛋白穩(wěn)定性。

大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)缺點8.真核細胞表達的特點及選擇⑴酵母表達系統(tǒng)

酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體和雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達⑵昆蟲細胞表達系統(tǒng)

優(yōu)點：可以表達較大的外源基因，可以同時表達多個外源基因?？梢詫崿F(xiàn)不同生物來源的外源基因的表達蛋白質(zhì)翻譯后加工（肽剪切糖基化）功能與高等生物相似，外源蛋白保持天然生物活性。生物安全性高⑶哺乳動物細胞

優(yōu)點：表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。缺點：生長慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度稀。技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性（一）選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效的地將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高純化倍數(shù)（二）收率要高（三）兩個技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟（四）整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求（五）二、基因重組蛋白的分離純化與分析鑒定分離純化技術(shù)要求：

基因工程藥物分離純化的一般流程發(fā)酵液細胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞破碎固液分離包涵體細胞碎片分離變性復(fù)

性濃縮初步分離高度純化制

劑產(chǎn)

品（一）基因重組蛋白的主要分離技術(shù)1.離心：是實現(xiàn)固液分離的重要手段。利用固體與液體間的密度差異來進行分離。優(yōu)點：分離速度快、分離效率高。缺點：設(shè)備投資大，能耗大。2.沉淀：利用蛋白質(zhì)在不同條件下的溶解度不同。等電點沉淀法鹽析法。3.膜分離：

1）滲透和透析：滲透是擴散過程，利用膜兩側(cè)滲透壓的差異使溶劑產(chǎn)生流動。透析是利用膜兩側(cè)的濃度差為驅(qū)動力，從溶液中分離出小分子物質(zhì)的過程。2）反滲透、超濾和微濾：都是以壓力差為驅(qū)動力。反滲透只允許溶劑通過，較大分子的鹽類被截留，主要起濃縮作用；超濾允許較大的分子通過，可同時實現(xiàn)濃縮和純化。3）電滲透：利用電位差的驅(qū)動，可脫鹽。4.雙水相萃?。?）原理：是水相中加入溶于水的高分子化合物形成密度不同的兩相體系2）影響雙水相萃取分配系數(shù)的因素：無機鹽濃度、聚合物的分子量、pH值及溫度。（二）基因重組蛋白的主要純化技術(shù)⑴離子交換層析（ionexchangechromatographyIEC）

基本原理:通過帶電的蛋白質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離純化的目的。

它具有分辨率高、容量大、操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。2.親和層析（affinityhromatography，AC）

親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。

配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。

載體：與配基結(jié)合的支撐物。親和層析大體可分五步：

①配基固定化②親和吸附目的物③洗滌④樣品解吸⑤再生3.凝膠過濾層析

凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內(nèi)，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。

根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子的動力學體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。

主要應(yīng)用兩個方面：

①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質(zhì)分子的分級分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。4.反相色譜（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離純化的。反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團與非極性固定相之間相互