實驗四 麥清蛋白的初步提取

實驗四麥清蛋白的初步提取生物111楊明軒1102040128一、研究背景及目的蛋白質(zhì)不僅是生物體中的重要大分子，在實際的生產(chǎn)生活中也有廣泛應(yīng)用。在科研中，研究生物的新陳代謝、揭示基因與表型的關(guān)系的機理，都涉及到蛋白質(zhì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析，要進行這些工作首要步驟就是提取和純化蛋白質(zhì)。提取得到的蛋白質(zhì)可被人們廣泛應(yīng)用，如小麥蛋白，其含較多的賴氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，營養(yǎng)平衡較好，其含量與改善面包和面條的品質(zhì)很有關(guān)系而蛋白質(zhì)的分離純化是科學(xué)研究和商品化開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。針對某一特定目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化要以其自身獨特的性質(zhì)為依據(jù)。但隨著對產(chǎn)物純度要求的提高，同一類物質(zhì)之間相似的性質(zhì)使得進一步精細分離難度加大，原有技術(shù)的不足也就逐漸體現(xiàn)出來。針對這一矛盾，人們以差異轉(zhuǎn)化為思路，在一定條件下，將大分子理化性質(zhì)的細微不同轉(zhuǎn)化成移動速度的差異，并通過移動距離的積累，實現(xiàn)大分子的精細分離。其中，層析技術(shù)憑借著獨特的優(yōu)勢始終占據(jù)著生物大分子純化的主導(dǎo)地位。根據(jù)分離要求的不同，層析技術(shù)可以分為分配柱層析、紙層析、薄層層析、離子交換柱層析、凝膠過濾層析、親和層析、高效液相色譜等。這些技術(shù)利用了生物大分子的各種理化性質(zhì)，有相似性但又各有區(qū)別。本實驗的目標(biāo)在于用利用分子篩層析完成麥清蛋白脫鹽，在實驗的過程中驗證層析技術(shù)的可行性，體會使用層析技術(shù)分離提純的原理和步驟，并由此對新技術(shù)的開發(fā)思路、理論與應(yīng)用的良好結(jié)合、新技術(shù)的發(fā)明對生物學(xué)相關(guān)研究和實驗的重要作用等方面的內(nèi)容有更感性的認識。二、實驗原理1、鹽析技術(shù)本實驗計劃用小麥種子制得的浸出液，在在這一步中，我們可利用蛋白質(zhì)的鹽析現(xiàn)象，即鹽濃度達到某一界限后，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度升高而降低。通過在混合液中添加一定濃度的中性鹽，使蛋白質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而可以使蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分離。本實驗中使用硫酸銨。2、層析技術(shù)的基本原理層析技術(shù)的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能的不同，或親和性的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)進行反復(fù)的吸附或分配作用。由于混合物中各物質(zhì)理化或親和性的差異，在層析過程中表現(xiàn)為移動速度的差異，這種差異經(jīng)過適當(dāng)?shù)淖銐蜷L及距離的積累，將各種物質(zhì)分離開來。3、凝膠過濾層析（分子篩層析或分子排阻層析）的原理凝膠過濾層析又稱分子篩層析，是利用固定相內(nèi)一定大小的網(wǎng)孔對相對分子質(zhì)量不同的組分的阻滯程度不同而進行蛋白質(zhì)分離的層析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的分離純化，也可用于蛋白質(zhì)的脫鹽。將蛋白質(zhì)樣品加在柱床表面，當(dāng)用緩沖液洗脫時，比凝膠珠網(wǎng)孔大的蛋白質(zhì)不能進入凝膠珠內(nèi)部，只能從凝膠珠的間隙里通過，受到的阻滯作用小，經(jīng)過的路徑短，先被洗脫下來；比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)則容易進入凝膠顆粒內(nèi)部，受到的阻滯作用答，經(jīng)過的路程長，后被洗脫下來。4、蛋白質(zhì)含量及鹽離子檢測定量收集柱層析中滴下的液體，并檢測蛋白質(zhì)含量和鹽的洗脫。因硫酸銨沒有紫外吸收峰，本實驗采用通過紫外分光光度儀測定收集到的各管的OD280的值判斷麥清蛋白峰值管；凝膠柱脫鹽的能力可以通過向收集的溶液中加入BaCl2看是否生成沉淀來判斷。4.1、蛋白質(zhì)含量（硫酸銨分級沉淀）在蛋白質(zhì)溶液中加入的大量硫酸銨會與溶液中大量水結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)表面水化層，使蛋白質(zhì)表面疏水基團暴露從而聚集沉淀。不同蛋白質(zhì)表面電性及水化層的厚度和穩(wěn)定度不同，因此加入不同濃度的硫酸銨可以對不同蛋白質(zhì)進行分離，因此稱為分級沉淀，是粗分離方法中較為精細的一種分離方式。另外，為了保證蛋白質(zhì)的活性分離常需要在低溫條件下進行，而硫酸銨的溶解度隨溫度變化不大，在低溫條件下仍有較大的溶解度，因此硫酸銨可有效進行蛋白質(zhì)分離。4.2、鹽離子檢測（BaCl2檢測法）(NH4)2SO4會與BaCl2反應(yīng)生成BaSO4沉淀，因此可以在收集液中加入少量BaCl2溶液，通過沉底產(chǎn)生情況檢驗?zāi)z過濾層析的脫鹽效果。需要注意的是，由于收集液中含有磷酸，而磷酸鋇是微溶物，所以BaCl2需要少量加入，防止產(chǎn)生磷酸鋇沉淀干擾檢驗。三、儀器與試劑1、儀器：UV9600紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）、TDL-40B低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、JP-100架盤藥物天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器廠）、BSZ-100自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）、層析柱（上海錦華層析設(shè)備廠）、SL-200型高速多功能粉碎機（浙江省永康市松青五金廠）、微量可調(diào)手動移液器（大龍）、指形管、小燒杯、研缽；2、試劑：飽和(NH4)2SO4、1%BaCl2、磷酸緩沖液、蒸餾水；3、材料：新鮮小麥種子、葡聚糖凝膠G-25。四、實驗方法1、溶脹凝膠（教師完成）稱取交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25適量，加入足量蒸餾水或洗脫液于沸水浴中溶脹5h或室溫溶脹過夜。溶脹平衡后，用玻璃棒適度攪拌使之充分懸浮后，稍靜置，待大部分凝膠沉降后，用虹吸法或傾瀉法除去含有細碎顆粒的上層液。如此反復(fù)多次，直至無顆粒為止。將漂洗好的凝膠在真空干燥器中減壓除氣，準(zhǔn)備裝柱。2、鹽析法分離提取麥清蛋白2g新鮮小麥種子粉碎，置于三角瓶中，加20ml蒸餾水，連續(xù)振蕩半小時，再間歇振蕩半小時。浸提體系以3000rpm離心20min取上清液。離心后的上清液有時需再過濾，上清液或濾液應(yīng)透明澄凈，用醋酸酸化濾液至pH4.7。攪拌狀態(tài)下加入等體積的飽和硫酸銨溶液，體系置于冰箱冷藏室過夜，使麥清蛋白全部鹽析沉淀出來?？紤]實驗三的處理方法，本實驗將體系置于冰箱中4h即可。鹽析充分后以3000rpm離心20min，棄去上清液，加2ml去離子水使沉淀充分溶解，得到麥清蛋白和硫酸銨混合液，準(zhǔn)備上樣洗脫脫鹽。3、裝柱取下層析柱上端柱帽，其下端止水，裝入1/4左右柱長的洗脫液，把溶脹好的凝膠邊攪拌邊倒入柱中，同時開啟洗脫，一次性連續(xù)裝柱直至層析柱長度的3/4左右。層析柱下端要適時止水以保證洗脫液面高于凝膠面3~5cm。待肉眼可見的凝膠沉降完成后，旋上上端柱帽并連上洗脫系統(tǒng)，平衡洗脫約3h。平衡過程中連接恒流泵及收集檢測系統(tǒng)，調(diào)節(jié)好流速和收集系統(tǒng)，待平衡完成后即可使用。本次實驗流速為6滴/min，收集量為每3ml/管。4、上樣打開層析柱上面的柱帽，放入略小于層析柱內(nèi)徑的濾紙片，使其自然飄落覆蓋在凝膠面上。利用恒流泵加速按鈕使洗脫液面與膠床表面相切甚至相齊，停止洗脫。然后吸取1ml樣品溶液，小心注入凝膠床面中央（勿沖動膠床）。加樣完畢，開啟洗脫，同時開啟收集器收集，待樣液與凝膠床面相齊時，迅速用滴管小心加入略高于剛才上樣高度的洗脫液，將殘留在柱子內(nèi)壁上的樣品集中洗入膠柱，如此沖洗兩次，以盡量避免樣品的稀釋以保證分離效果。之后，用滴管小心加入3~5cm高的洗脫液層，帶上柱帽，連續(xù)洗脫收集。5、洗脫，收集和鑒定計時收集，每3ml收一管。用分光光度計監(jiān)測280nm處監(jiān)測消光值從而完成蛋白質(zhì)的收集。記錄每管的消光值，以管好為橫坐標(biāo)，以消光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，確定蛋白峰值管。待確定脫鹽效果后留存蛋白峰值管，在后續(xù)的SDS實驗中，測定其分子量并檢測本次實驗的純化效果。比色完畢后，在各管中（不包括蛋白峰值管）分別滴加2滴1%BaCl2溶液，以確定哪些管中有SO42-。在蛋白峰值管中取200μl溶液轉(zhuǎn)移儲存之后，再加入BaCl2溶液。五、實驗數(shù)據(jù)管號12345678910OD2800.0190.0130.010.0110.0110.0130.0221.0781.2330.704SO42管號11121314151617181920OD2800.3360.1280.090.0750.0630.0620.060SO42+++++++--管號2122OD280SO42六、結(jié)果處理與分析1、結(jié)果計算根據(jù)上面的數(shù)據(jù)，繪制麥清蛋白的洗脫曲線如下圖1。（注：管中出現(xiàn)SO42-記為1，不出現(xiàn)SO42-記為0。）（二）分析與討論對于麥清蛋白的洗脫，我們以測定的OD280值為0.1作為基線：大于0.1說明管中含有大量蛋白質(zhì)，小于0.1說明管中蛋白含量很低；峰值出現(xiàn)后，連續(xù)三管低于0.1則可認為蛋白洗脫完成?；谝陨峡紤]，從圖中可以看出，前7管中蛋白含量很低，到第8管出現(xiàn)峰值，第8、9管蛋白含量均較高，而從第10管開始，數(shù)值開始下降，直至第14管才出現(xiàn)連續(xù)3管的OD280均低于0.1，說明蛋白洗脫已經(jīng)完成。出現(xiàn)這樣的結(jié)果，說明蛋白并沒有被集中洗脫下來，峰值出出現(xiàn)明顯的劈裂現(xiàn)象，后峰值階段有較明顯的拖尾效應(yīng)；這說明本次實驗中的操作存在一定的問題，具體的將在后續(xù)部分中進行討論。而對SO42-的洗脫，從圖中看出，前12管都不含有SO42-，從第13管開始出現(xiàn)SO42-，到第20管已經(jīng)洗脫完成。與蛋白的洗脫曲線對照，說明蛋白大量洗脫的時候沒有SO42-被洗脫下來，成功實現(xiàn)了蛋白質(zhì)與SO42-的分離，達到了本次實驗的目的。七、結(jié)論與延展本次實驗中，我們以麥清蛋白的脫鹽為例，進行了凝膠過濾層析的操作，結(jié)果表明，凝膠過濾層析能夠有效地將麥清蛋白和小分子無機鹽給分離開來，達到了實驗?zāi)康摹牡鞍踪|(zhì)洗脫曲線可以看出，上升部分較為迅速，沒有明顯的拖延情況，說明上樣中所有蛋白質(zhì)基本處于同一起點被洗脫，操作較為成功；但最高峰出現(xiàn)明顯而嚴重的劈裂現(xiàn)象，說明原本應(yīng)該在一個峰值管中的蛋白質(zhì)被因為3min的換管均分到了兩個管中。蛋白質(zhì)峰值管后出現(xiàn)了一個消光值較高的收集管，下降部分稍有拖尾，考慮到實驗中的操作，可能是在洗滌殘余樣品的過程中第一次加入的磷酸鹽緩沖液量較大（600ul），樣品可能被稀釋，因此出現(xiàn)了較為明顯的拖尾現(xiàn)象。實驗中，我們發(fā)現(xiàn)層析技術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)要求的分離目標(biāo)，但是操作相對繁瑣，所需要的樣品量較大，分離時間較長，同時對于峰值出現(xiàn)的時機無法很好的把握導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)嚴重劈裂現(xiàn)象，通過查閱文獻及討論，我們認為基于學(xué)生實驗的要求及條件限制，劈裂現(xiàn)象無法避免；而對于實驗室中對于未知蛋白的分離層析，可以通過降低分光光度計需要樣品量以增加收集管數(shù)量減少單一管蛋白樣品量，或者通過借鑒電泳技術(shù)中溴酚藍指示的思路，是否可以通過標(biāo)記樣品最前沿的方法，對蛋白質(zhì)洗脫情況進行預(yù)判。同時對于自動部分收集器的改進，考慮到使用中首先按鍵式操作不如電子智能式簡潔；對于很難獲取的且具有很大價值的蛋白的層析，鑒于一般分光光度計測量最低量及部分收集器的局限，同時對于一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的測定，考慮是否可以將兩者功能合并，在部分收集器底座加裝分光光度燈及分析裝置，可以有效避免收集和測量間環(huán)境對樣品的干擾影響。而對于改進分光光度計待測量的改進，我考慮是否可以通過改變發(fā)光部位，將光由上部射出，光板改為在樣品下方，同時將收集器滴頭改為對光不吸收的材質(zhì)，這樣可以通過減少暗室下底半徑，使得每一滴樣液都可以覆蓋下底以達到對微量樣品測量的目的。八、思考題用凝膠過濾層析法分離混合樣品時，為了得到較好的分離效果，根據(jù)技術(shù)的理論特點，你認為在實驗前的實驗設(shè)計階段主要要注意哪些方面？為什么？而在實驗的具體操作方面，你認為關(guān)鍵步驟又有哪些？為什么？答：1.實驗設(shè)計階段需要注意一下幾點：1）填料的選取。分子篩主要依據(jù)的基本性質(zhì)是混合樣品中各組分分子大小差異。而將這種分子大小差異轉(zhuǎn)化為速度差異主要是通過填料顆粒的孔徑實現(xiàn)的。因此在實驗前需要依據(jù)不同組分的分子大小選擇合適孔徑的填料以完成分離。同時，填料最好不要帶有表面電荷，減小由于填料對樣品的吸附或排斥影響其洗脫速度；且填料的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在洗脫過程中不會與樣品組分或洗脫液發(fā)生反應(yīng)影響洗脫速度。2）柱長及層析柱直徑的確定。在實驗的基本設(shè)計中將分子大小的差異轉(zhuǎn)化為速度的差異，而速度差異需要距離的積累來體現(xiàn)，不可過短。所以要根據(jù)被分離物質(zhì)和雜質(zhì)的分子大小及成本確定一個合適的柱長以有效完成分離。由于層析柱會對樣品產(chǎn)生管壁效應(yīng)，直徑較大的層析柱樣品受到管壁效應(yīng)的影響相對要小，所以需要考慮成本和其他實際因素下確定合適的柱直徑。3）洗脫速度的確定。在洗脫過程中洗脫速度若太快，樣品中各組分就會被洗脫液沖下，而不是依據(jù)其分子大小自然洗脫，分子篩便失去了其分子篩的分離功能。所以在洗脫中需要確定一個合適的洗脫速度，既能保證樣品的自然洗脫又不會使洗脫時間過長。2.實驗操作中的關(guān)鍵步驟步驟具體操作作用或目的裝柱（保持凝膠顆粒的完整性和凝膠的均一性）裝柱前在柱中倒入磷酸緩沖液至1/4~1/3左右柱長。防止傾倒凝膠時凝膠砸在下層篩絹上破壞凝膠顆粒，堵塞篩絹，影響洗脫效果，所以至少要倒至柱長1/4處；為減少后續(xù)傾倒凝膠次數(shù)，減少產(chǎn)生界面的概率，完成一次性連續(xù)裝柱，所以最多倒至柱長1/3處。攪拌凝膠至懸浮狀態(tài)，邊攪拌邊將其倒入柱中，多次傾倒時需要在沉淀界面和懸浮界面完全重合前傾倒。最后倒膠至柱長3/4處。由于柱長及已有磷酸緩沖液的限制，不可能一次性倒膠至指定位置，因此客觀需要多次倒膠。此步驟是為了完成一次性裝柱，凝膠柱不出現(xiàn)界面，保證凝膠柱的均一性。適時止水，使凝膠沉下，保持磷酸緩沖液高于柱面3~5cm。待凝膠完全沉下，開啟連續(xù)洗脫體系平衡3h左右。始終保持液面高于柱面是為了防止凝膠柱因脫水而毀膠；待凝膠完全沉淀可保證柱面的平整性，保證后續(xù)上樣的同一起點。平衡過程可平衡固定相和流動相，保證洗脫過程中固定相的穩(wěn)定靜止。上樣在層析柱頂端加入一個直徑略小于