生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)示范報(bào)告-蔗糖酶的提取與純化(正確)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)示范報(bào)告:實(shí)驗(yàn)名稱：蔗糖酶的分離提取與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1．掌握蔗糖酶分離提純的原理與實(shí)驗(yàn)操作方法；2．掌握有機(jī)溶劑分級(jí)純化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的離子交換層析法純化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及測(cè)定原理、計(jì)算和操作方法；4．鞏固并熟練掌握Folin法測(cè)定牛血清蛋白和3、5-二硝基水楊酸法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，并能通過回歸方程測(cè)定還原糖及蛋白質(zhì)的含量。實(shí)驗(yàn)原理：蔗糖酶分離提純?cè)恚航湍钢械恼崽敲负亢茇S富，實(shí)驗(yàn)以安琪酵母粉為原料，首先采用自溶法破碎細(xì)胞壁、再用乙醇分級(jí)和DEAE—纖維素柱層析兩步分離提純，制備純度較高的蔗糖酶制劑。酶分離提純的原理與蛋白質(zhì)的相同。但酶是有催化活性的蛋白質(zhì)，在分離提純過程中必須注意：防止酶變性失活；隨時(shí)測(cè)定酶的比活力，并跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度及得率。有機(jī)溶劑分級(jí)純化蔗糖酶原理：利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑—乙醇中溶解度的差異將蔗糖酶蛋白與其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)進(jìn)行有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀，而使提取的蔗糖酶得以純化（32％的乙醇飽和度沉淀分離雜蛋白，47.5％的乙醇飽和度沉淀分離酶蛋白）。操作必須在低溫下進(jìn)行且避免有機(jī)溶劑局部過濃；分離后應(yīng)立刻除去有機(jī)溶劑并用水或緩沖溶液溶解沉淀的酶蛋白（復(fù)溶），確保酶的活性；pH多選在酶蛋白的等電點(diǎn)附近；有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度減少變性，提高分離效果。蔗糖酶的離子交換層析法純化原理：本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-纖維素（DEAE-C11）微粒狀的、弱堿性的陰離子纖維素為柱料，進(jìn)行蔗糖酶的進(jìn)一步純化。它具有分辨率高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、有開放性的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)、有較大的表面積、對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量大等優(yōu)點(diǎn)；纖維素上離子基團(tuán)的數(shù)量不多，排列疏散，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固，用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離的目的，不致引起蛋白質(zhì)的變性。蔗糖酶活力與比活的測(cè)定：在蔗糖酶的純化過程中，通過3、5-二硝基水楊酸法測(cè)定蔗糖酶催化蔗糖生成還原糖的量，測(cè)定酶活力大小，跟蹤酶的活力。在本實(shí)驗(yàn)條件下，每3min釋放lmg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位；通過Folin法測(cè)定酶蛋白的含量，計(jì)算蔗糖酶的比活。單位質(zhì)量的酶蛋白中所含酶的活力稱為酶的比活。主要實(shí)驗(yàn)器材：1.試管、血糖管；2.秒表；3.冰鹽??；4.恒溫水浴；5.離心機(jī)；6.721-型分光光度計(jì)；7.柱層析裝置；8.梯度洗脫裝置；9.部分收集器；10.電磁攪拌器；11.冰箱；12.DEAE—纖維素。

實(shí)驗(yàn)操作1．蔗糖酶的分離提純（1）．蔗糖酶粗品的制備流程：250mL具塞三角瓶＋酵母粉＋1.5g乙酸鈉＋25mL甲苯于35oC恒溫水浴中攪30min→補(bǔ)加水60mL，攪勻，用塑料薄膜封口，35℃保溫過夜→自溶液于4000r/min離心20min，取中間水層液再次在4000r/min離心20min，得無細(xì)胞抽提液（初酶E1）→測(cè)量初酶液的體積V1，并取出5mL待測(cè)酶活力和實(shí)驗(yàn)得到的初酶液體積V1=48.5mL，留5mL測(cè)酶活及酶蛋白，其余43.5mL做后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)。（2）．乙醇分級(jí)和透析流程：將43.5mL初酶液用稀醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5→32％的乙醇飽和度除雜蛋白（計(jì)算所需95％乙醇的量并與初酶液在冰鹽浴中預(yù)冷，緩慢滴加95％乙醇并不斷攪拌。滴加結(jié)束后，于4000r／min離心5min，留取上清液）→再用95％乙醇調(diào)節(jié)酶液到47.5％的乙醇飽和度，沉淀蔗糖酶（此時(shí)需準(zhǔn)確計(jì)算出使粗酶液的乙醇濃度達(dá)47.5％時(shí)所需補(bǔ)加95％乙醇的體積；按上述方法加入乙醇后于4000r／min離心5min）→透析（沉淀立刻用10mL0.005mol／L，pH6.0的磷酸鈉緩沖液溶解后，轉(zhuǎn)入透析袋中，將透析袋放入500mL燒杯中，加清水透析過夜（中間換一次清水）→次日，將透析液離心得酶液E2，準(zhǔn)確測(cè)量出酶液E2的體積Ｖ2，并取出5mL待測(cè)酶液，測(cè)定酶的活力和蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)得到的乙醇分級(jí)和透析純化后的酶液體積為13.8mL，考慮到初酶液留下的5mL，則純化后的酶液體積校正后應(yīng)為：V2=13.8×48.5/(48.5-5)=15.39(mL)。問題1:乙醇分級(jí)純化的目的是什么？分級(jí)純化后透析的目是什么?2：乙醇分級(jí)和透析純化后的酶液體積為什么需要進(jìn)行校正？如何較正？（3）．DEAE—纖維素離子交換層析法純化：（由于實(shí)驗(yàn)條件和學(xué)時(shí)數(shù)所限，此步省略）

2．牛血清蛋白和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線定制（1）Folin法定制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：按表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并記錄A650nm處測(cè)得的各濃度對(duì)應(yīng)的OD值，一并填入下表中。再以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1Folin法定制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)加樣操作及數(shù)據(jù)記錄表表2Folin法定制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線微機(jī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表（2）3、5-二硝基水楊酸法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線定制：按表3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并記錄A540nm處測(cè)得的各濃度對(duì)應(yīng)的OD值，一并填入下表中。再以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。表中試劑混勻后，在沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，取出后立即用冷水冷卻，加蒸餾水定容至25mL，搖勻，用lcm的比色杯于540nm處測(cè)光密度值。表33、5-二硝基水楊酸法定制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)加樣操作及數(shù)據(jù)記錄表表43、5-二硝基水楊酸法定制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線微機(jī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表3．蔗糖酶活力、蛋白濃度、比活力的測(cè)定（1）通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定酶活測(cè)定以及酶蛋白含量時(shí)酶的稀釋倍數(shù).（2）蔗糖酶活力測(cè)定操作：取2支試管，1支加入用pH4.6，0.2mol／L的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋過（稀釋倍數(shù)均為50）的酶液（E1、E2）2mL，另一支加入2mL5％的蔗糖液，把兩支試管放入35℃水浴中預(yù)熱恒溫。3分鐘后，將2mL蔗糖加入到酶液試管中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，3min后于測(cè)定管中加入0.5mL1mol／L的NaOH，搖勻，終止酶促?gòu)拿复俜磻?yīng)液準(zhǔn)確移取0.5mL溶液放入血糖管中，加入2mL2%的3,5-二硝基水楊酸試劑搖勻。于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，加水稀釋至定容至25mL，搖勻后，于540nm處測(cè)光密度。問題3:測(cè)定蔗糖酶活力時(shí)，酶液為什么要進(jìn)行稀釋？如何確定酶液的稀釋倍數(shù)？4:測(cè)定蔗糖酶活力時(shí)，反應(yīng)液中先后加入0.5mL1mol／L的NaOH的目的是什么？實(shí)驗(yàn)測(cè)得：稀釋50倍的粗酶液催化生成還原糖的吸光度A初葡萄糖=0.231；乙醇分級(jí)純化后稀釋50數(shù)的酶液催化生成還原糖的吸光度A純葡萄糖=0.683（3）酶蛋白濃度測(cè)定： 分別將初酶液(稀釋100倍)與乙醇分級(jí)純化后的酶液(稀釋10倍)按Folin法進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定。問題5：測(cè)定酶蛋白濃度時(shí)，酶液是否需要進(jìn)行稀釋?實(shí)驗(yàn)測(cè)得：初酶液中蛋白質(zhì)顯色反應(yīng)測(cè)得的吸光度A初蛋白質(zhì)=0.384；乙醇分級(jí)純化后蛋白質(zhì)顯色反應(yīng)測(cè)得的吸光度A純蛋白質(zhì)=0.490將以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.0155X-0.0046計(jì)算蛋白質(zhì)含量。初酶液中蛋白質(zhì)濃度=100×[6×(0.384＋0.0046)/0.0155]/1000=15.04（mg/mL）初酶液中蛋白質(zhì)含量=48.5×15.04=729.57(mg)乙醇分級(jí)純化后蛋白質(zhì)濃度=10×[6×(0.490＋0.0046)/0.0155]/1000=1.915（mg/mL）乙醇分級(jí)純化后蛋白質(zhì)含量=15.39×1.915=29.47(mg)（4）酶活力測(cè)定的相關(guān)數(shù)據(jù)處理a.通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定得到的回歸方程：Y=0.00318X+0.0082（Y為吸光度，X為糖濃度）將測(cè)得的吸光度代入回歸方程，分別計(jì)算出蔗糖酶純化前后催化生成的葡萄糖的量（mg）初酶稀釋液催化生成的葡萄糖濃度C初葡萄糖=[50×(A初葡萄糖－0.0082)/0.0032]/1000=[50×(0.231－0.0082)/0.0032]/1000=3.4813(mg/mL) 2mL初酶稀釋液催化生成的葡萄糖量（mg）=4.5×初酶液催化生成的葡萄糖濃度C初葡萄糖=15.67（mg）初酶酶活濃度=50×初酶液催化生成的葡萄糖毫克數(shù)/參與反應(yīng)酶體積=50×15.67/2=391.75（U/mL）初酶液總酶活=初酶酶活濃度×初酶液體積=391.75×48.5=18999.88（U）乙醇分級(jí)純化后稀釋酶液催化生成的葡萄糖濃度C純葡萄糖=[50×(A純葡萄糖－0.0082)/0.0032]/1000=[50×(0.683－0.0082)/0.0032]/1000=10.54(mg/mL)2mL純酶稀釋液催化生成的葡萄糖量（mg）=4.5×純酶液催化生成的葡萄糖濃度C初葡萄糖=47.43（mg）；純化后酶的酶活濃度=50×純酶液催化生成的葡萄糖毫克數(shù)/參與反應(yīng)酶體積=50×47.43/2=1185.75（U/mL）純酶液總酶活=純酶液酶活濃度×純酶液體積×純酶液稀釋倍數(shù)=1185.75×15.39=18248.69（U）（5）酶比活、提純倍數(shù)及回收率的計(jì)算：初酶液酶比活=初酶液總活力/初酶液中蛋白質(zhì)含量=18999.88/729.57=26.04(U/mg)乙醇分級(jí)純化后酶液的比活=1837.6/29.47=619.23(U/mg)蔗糖酶的提純倍數(shù)=乙醇分級(jí)純化后酶液的比活/初酶液酶比活=619.23/26.04=23.78（倍）蔗糖酶的回收率=乙醇分級(jí)純化后酶液總活力/初酶液總活力=18248.69/18999.88=96.05%實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)與結(jié)果討論1．實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析總結(jié)：（此分析結(jié)果不涉及離子交換柱層析的純化處理）通過實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)可以明顯看出：在提取蔗糖酶過程中，采用乙醇分級(jí)純化透析處理后，得到的蔗糖酶其總活力略有下降，但其階段收率任能達(dá)到96.05%；同時(shí)其比活力明顯提高，提純倍數(shù)達(dá)到23.77倍。回顧整個(gè)蔗糖酶提取及純化操作，為提高階段收率保持酶的總活力，在操作過程中需注意以下環(huán)節(jié)：首先是在乙醇的分級(jí)純化時(shí)，應(yīng)根據(jù)蔗糖酶蛋白與其它雜蛋白因結(jié)構(gòu)及分子大小不同等特性，選擇好適宜的乙醇濃度除去雜蛋白，沉淀、純化分離到蔗糖酶。其次是在酶的純化過程中，要確保酶只發(fā)生可