槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌生長及機(jī)理研究

槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌生長及機(jī)理研究

蝗蟲糖是一些國外細(xì)菌產(chǎn)生的糖脂表面活性劑，由球形細(xì)胞（tyluus）和假單胞菌（cylidia）產(chǎn)生。由于其高產(chǎn)量高，表面性能好，具有低毒和生物分解等優(yōu)點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于食品、藥物、石油、化工、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域?，F(xiàn)代研究表明槐糖脂具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒等多種生物活性。金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是一種可引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌,也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本實(shí)驗(yàn)基于槐糖脂的相關(guān)報(bào)道,針對常見的病原細(xì)菌和植物病原菌,對槐糖脂的抑菌作用及在不同溫度和pH值條件下槐糖脂的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,并針對槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行探究,旨在為今后槐糖脂的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基槐糖脂:由假絲酵母菌(Candidabombicola)利用葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)生。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯抽提后,減壓干燥,正己烷洗滌,干燥得到槐糖脂。病原細(xì)菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogene)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為本實(shí)驗(yàn)室保存。植物病原菌:番茄葉霉病菌(Fulviafulva)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、茄子黃萎病菌(Verticilliumdaliae)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系。LB培養(yǎng)基:氯化鈉10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g、水1000mL,pH7.0;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、水1000mL,自然pH值。1.2設(shè)備和設(shè)備KYKY-EM3200數(shù)字化掃描電子顯微鏡北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司;H-7650透射電鏡日本日立公司。1.3lb培養(yǎng)基條件除特殊指出的影響因素以外,抑菌作用研究中所有條件均為菌體生長的最適條件,即細(xì)菌均采用LB培養(yǎng)基,E.coli,37℃;S.aureus,37℃;P.putida,30℃;L.monocytogenes,37℃;植物病原菌均采用PDA培養(yǎng)基,28℃。1.4懷糖脂對每個(gè)受試菌株的抗菌作用利用濾紙片法和液體倍比稀釋法對病原微生物的抑菌作用及最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)進(jìn)行測定。1.5ph值和溫度對槐糖脂的影響1.5.1ph值測定槐糖脂在3、4、5、6、7、8、9共7種不同pH值情況下對S.aureus的抑菌作用,以槐糖脂質(zhì)量濃度為0時(shí)作為對照。1.5.2溫度測定槐糖脂分別在60、100、120℃的條件下保溫30min后對S.aureus的抑菌作用,以未處理的樣品作對照。1.6關(guān)于金融體葡萄糖對金色病原體的抗菌機(jī)制的分析1.6.1兩組治療后總體規(guī)劃將S.aureus培養(yǎng)到對數(shù)生長期,分成實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組加入3.125mg/mL槐糖脂,之后與對照組同步繼續(xù)培養(yǎng),用分光光度計(jì)檢測槐糖脂作用后S.aureu菌量的變化,繪制生長曲線。1.6.2生物超微結(jié)構(gòu)的測定菌體制備同1.6.1節(jié),設(shè)定藥物作用時(shí)間分別為4h和8h,取1.5mL樣品溶液,按掃描電鏡及透射電鏡生物樣品制備法制樣,在電鏡下觀察菌體外觀形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。2結(jié)果與分析2.1革蘭氏陽性菌的抑制作用從表1可以看出,槐糖脂對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和植物病原菌沒有抑制作用。對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、單增李斯特菌具有較好的抑制作用,其中對S.aureus的抑菌作用最明顯,最低抑菌質(zhì)量濃度為1.5625mg/mL。Yoo等也報(bào)道了槐糖脂能夠強(qiáng)烈抑制革蘭氏陽性菌如Bacillus、Staphylococcus和Streptococcussp.的生長,但對大腸桿菌(Escherichiacoli)的生長沒有抑制作用。這主要是由于細(xì)菌細(xì)胞壁組成及結(jié)構(gòu)的差異,生物表面活性劑對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌有更顯著的抑制作用。2.2ph和溫度對降低金氏合金對黃河病原體的影響2.2.1ph值呈堿性時(shí)多聚羥基脂肪酸內(nèi)槐糖脂是一種可降解的生物表面活性劑,具有較高的選擇性,其表面活性受極端溫度、pH值、鹽度等條件影響小。如表2所示,槐糖脂對S.aureus的MIC表現(xiàn)為:酸性及中性情況抑菌作用穩(wěn)定,堿性情況抑菌作用次之。分析其原因,可能是pH值呈堿性時(shí)改變了槐糖脂的結(jié)構(gòu)。不同類型的槐糖脂有共同的結(jié)構(gòu)特征,每個(gè)分子由親水性和疏水性兩部分構(gòu)成,親水性部分是槐糖,疏水性部分是飽和或不飽和的長鏈ω-(或ω-1)羥基脂肪酸。區(qū)別在于它們所含脂肪酸碳鏈的長度不同、飽和程度不同、乙?；潭炔煌约笆欠翊嬖趦?nèi)酯化作用。當(dāng)pH值呈堿性時(shí),一方面有可能與脂肪酸形成酯,另一方面有可能使原有的內(nèi)酯化作用破壞。因此,槐糖脂宜在酸性條件下使用,其抑菌pH值范圍為3~7。2.2.2最小抑菌濃度由表3可知,槐糖脂經(jīng)不同溫度處理后接種的平板未見菌落長出,且與處理前樣品的最小抑菌質(zhì)量濃度一樣。說明經(jīng)熱處理后槐糖脂仍然具有很好的抑菌效果,表明槐糖脂具有良好的耐熱性,高溫處理并不改變槐糖脂的性質(zhì)。2.3結(jié)果表明，懷糖脂可抑制金屬絲培養(yǎng)金屬絲培養(yǎng)的結(jié)果2.3.1生長曲線分析如圖1所示,與正常S.aureus相比,當(dāng)加入槐糖脂后其生長曲線明顯變化。正常S.aureus20h內(nèi)呈正常生長曲線,實(shí)驗(yàn)組不能形成生長曲線,且作用明顯。該對比生長曲線表明,槐糖脂主要抑制了S.aureus對數(shù)生長期的菌體分裂。在細(xì)菌生長到對數(shù)生長期時(shí)加入槐糖脂,菌體數(shù)目顯著減少,并沒有達(dá)到正常的生長高峰,之后進(jìn)入衰亡期,其菌量僅達(dá)到了正常生長菌的1/4。2.3.2經(jīng)槐糖脂處理的菌體形態(tài)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察是研究抑菌機(jī)理不可缺少的直接證據(jù)。掃描電鏡下觀察,正常的S.aureus細(xì)胞表面光滑、圓潤,呈球狀,細(xì)胞與細(xì)胞間界限分明,細(xì)胞排列呈明顯的葡萄串狀(圖2A),與文獻(xiàn)報(bào)道一致。經(jīng)槐糖脂處理4h后,金黃色葡萄球菌的排列變得松散,無規(guī)律,不能聚集成葡萄狀(圖2B)。經(jīng)槐糖脂處理8h后,細(xì)胞間的界限略變模糊,部分菌體發(fā)生結(jié)團(tuán)現(xiàn)象(圖2C)。細(xì)胞間的界限變模糊,說明部分菌體細(xì)胞壁已經(jīng)被破壞,細(xì)胞壁的降解物多糖類物質(zhì)在菌體細(xì)胞附近聚集,從而使細(xì)胞黏結(jié)成團(tuán)塊狀。透射電鏡下觀察,正常的S.aureus菌體飽滿近圓形,邊緣清晰,細(xì)胞質(zhì)分布均勻(圖2D)。經(jīng)槐糖脂處理4h后的菌體,菌體有些變形,位于細(xì)胞膜區(qū)出現(xiàn)一些小的空泡(圖2E)。經(jīng)槐糖脂處理8h后,金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)固縮,空腔增大,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多空腔,細(xì)胞嚴(yán)重受損(圖2F)。這表明,槐糖脂能夠?qū)е耂.aureus細(xì)胞質(zhì)固縮,形成空洞,細(xì)胞代謝無法正常進(jìn)行,最終導(dǎo)致菌體死亡。3增李菌、槐糖脂最佳抑菌ph值的確定抑菌實(shí)驗(yàn)表明槐糖脂對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和植物病原菌沒有抑制作用。對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、單增李斯特菌具有較好的抑制作用,其