中藥乙醇提取物祛黃褐斑作用的比較研究

中藥乙醇提取物祛黃褐斑作用的比較研究

黃褐斑是皮膚科最常見(jiàn)的疾病之一?，F(xiàn)在，主要采用戶外藥物（護(hù)毒劑）的治療方法來(lái)改善癥狀。祛黃褐斑劑是指可降低皮膚色素或減輕色素沉著的天然或人工合成的化合物。人工合成品因其不良反應(yīng)明顯,臨床應(yīng)用受到限制。近年來(lái)從植物中分離天然的活性成分用于黃褐斑、雀斑等色素增加性皮膚病的治療使用越來(lái)越普遍,目前國(guó)內(nèi)外此類(lèi)研究報(bào)道雖然較多,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大,結(jié)論不統(tǒng)一。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)甘草、白芷、白附子、銀花、當(dāng)歸、僵蠶、五倍子、藁本、沙苑子、繁縷、白芨、滿天星、六月雪、柿葉有祛黃褐斑作用,以白附子、銀花、白芨、六月雪4味中藥乙醇提取物作用較為突出。為進(jìn)一步比較各味中藥乙醇提取物的祛黃褐斑作用,以期從中篩選出一種中藥乙醇提取物,本研究以小鼠B16黑素瘤細(xì)胞作為受試對(duì)象,以中藥乙醇提取物對(duì)B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制率、酪氨酸活性抑制率、黑素合成抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),研究了4種中藥乙醇提取物的祛黃褐斑作用,為從中藥乙醇提取物中提取祛黃褐斑有效成分單體并研制成祛黃褐斑制劑奠定基礎(chǔ)。1材料1.1材料細(xì)胞株:小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株(中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室)。胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)(Amre公司),4-甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司),左旋多巴(3,4-dihydroxy-DL-phenylalanrine,Sigma公司),TritonX-100(Amresco公司),DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清。D-hank’s液由中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室提供。藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室周日寶教授鑒定符合中國(guó)藥典2010版一部要求。95%乙醇(批號(hào):20091030,中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室)。1.2儀器SW-CJ-1BU型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);MCO-175型CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);CKX-31型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);RT-6100酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司);SZ-97A型自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);SK3300H超聲液清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);FW135型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。2方法與結(jié)果2.14味中藥乙醇提取物制備取白附子、銀花、白芨、六月雪各味中藥分別粉碎,過(guò)40目篩,各稱取30g粉末,分別加8倍量20%乙醇,浸泡1h。超聲提取30min(功率250W,頻率40kHz),過(guò)濾。同法再提取1次,合并2次濾液,減壓濃縮至相當(dāng)于原生藥材1g·mL-1。2.2小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24h換液1次,每3d用0.25%的胰酶消化傳代1次,細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)可進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)用第3~4代細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期,用D-hank’s液洗滌,0.25%胰酶消化,制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),然后接種至細(xì)胞培養(yǎng)板待測(cè)。隨后將分別用于細(xì)胞增殖率測(cè)定、酪氨酸酶活性和黑素含量測(cè)定。2.3細(xì)胞增殖的測(cè)定采用4-甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,常規(guī)胰酶消化處理后吹打成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞的質(zhì)量濃度為調(diào)為5×104個(gè)·mL-1,分為6組接種于96孔板,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,每孔加入100μL培養(yǎng)液稀釋好的中藥乙醇提取物使藥物質(zhì)量濃度為(500、250、125、62.5μg·mL-1,每個(gè)質(zhì)量濃度為設(shè)立3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)立空白對(duì)照組(培養(yǎng)基+細(xì)胞組),置于孵箱48h后,每孔加入MTT液20μL(5mg·mL-1),在孵箱中作用4h后,棄上清液,每孔加入100μLDMSO,震蕩10min左右,用酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-藥物處理組A490/空白對(duì)照組A490)]×100%2.4酪氨酸酶活性測(cè)定細(xì)胞接種方法和對(duì)照組的設(shè)立同“2.3”項(xiàng)下方法。藥物作用48h后,棄上清液,用PBS液洗2遍,然后每孔加入100μL1%TritonX-100震蕩5min,置于-20℃1h,隨室溫融化,使細(xì)胞完全裂解。每孔加入100μL0.1%左旋多巴液(PBS配制),37℃孵育2h,490nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。酪氨酸酶活性抑制率=(1-藥物處理組A490/空白對(duì)照組A490)×100%2.5黑素含量測(cè)定采用NaOH裂解法。細(xì)胞接種方法和對(duì)照組的設(shè)立同“2.3”項(xiàng)下方法。藥物作用72h后,棄上清液,用PBS液洗2遍,然后加入100μL1mol·L-1NaOH,37℃水浴1h,用酶標(biāo)儀測(cè)定460nm波長(zhǎng)的吸光度值。黑素合成抑制率=(1-藥物處理組A460/空白對(duì)照組A460)]×100%2.6結(jié)果及數(shù)據(jù)處理將4味中藥乙醇提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖抑制率,酪氨酸酶活性抑制率,黑素合成抑制率分別進(jìn)行線性規(guī)劃,結(jié)果表明均與質(zhì)量濃度不成線性,也無(wú)法建立數(shù)學(xué)方程(無(wú)相關(guān)性)。于是將4味中藥乙醇提取物中的4個(gè)質(zhì)量濃度作為16個(gè)獨(dú)立變量,共同按95%可信區(qū)間重疊法(ˉx±tα,υ?s/√n)進(jìn)行兩兩比較的差異性檢驗(yàn)(α=0.05,υ=2),實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1~3。由表1結(jié)果可知,白附子、白芨各濃度,銀花濃度為250與125μg·mL-1,500、250與62.5μg·mL-1六月雪95%可信區(qū)間分別重疊,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余均具有統(tǒng)計(jì)意義;在銀花各濃度中,濃度為62.5μg·mL-1時(shí),對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用最強(qiáng)。六月雪濃度為500、250、62.5μg·mL-1時(shí),對(duì)黑素瘤增殖抑制率均較強(qiáng)。綜合分析:細(xì)胞增殖抑制作用由大到小順序?yàn)?62.5μg·mL-1銀花≈白附子各濃度≈白芨各濃度>500、250、62.5μg·mL-1六月雪濃度。由表2結(jié)果可知,白附子濃度500與250μg·mL-1、500與62.5μg·mL-1,銀花濃度500與250μg·mL-1,500與62.5μg·mL-1,250與125μg·mL-1,白芨濃度500與250μg·mL-1以及六月雪各濃度95%可信區(qū)間分別重疊,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余均有統(tǒng)計(jì)意義。在白附子各濃度中,濃度為250μg·mL-1時(shí)對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用最強(qiáng)。在銀花各濃度中,濃度為62.5μg·mL-1時(shí),抑制作用最強(qiáng)。在白芷各濃度中,濃度為為250μg·mL-1時(shí),抑制作用最強(qiáng)。綜合分析:酪氨酸酶活性抑制作用由大到小順序?yàn)?250μg·mL-1白附子≈62.5μg·mL-1銀花>250μg·mL-1白芨≈六月雪各濃度。由表3結(jié)果可知,白附子濃度為250與62.5μg·mL-1,銀花各濃度,白芨濃度為125與62.5μg·mL-1,125與500μg·mL-1,500與250μg·mL-1以及六月雪各濃度95%可信區(qū)間分別重疊,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余均有統(tǒng)計(jì)意義。在白附子各濃度中,濃度為125μg·mL-1時(shí),黑素合成抑制率作用最強(qiáng)。在白芨各濃度中,濃度為125μg·mL-1時(shí),抑制率作用最強(qiáng)。綜合分析,黑素合成抑制率由大到小為:125μg·mL-1白附子>125μg·mL-1白芨≈銀花各濃度≈六月雪各濃度。3討論黃褐斑是世界疑難雜癥之一,屬于面部黑變病的一種,是發(fā)生在顏面的色素沉著斑。因此在研究開(kāi)發(fā)更有效的祛斑藥物過(guò)程中,黑素生成以及酪氨酸酶活性的變化一直都是評(píng)論藥物療效好壞的重要依據(jù)。在此基礎(chǔ)上篩選出的許多藥物已經(jīng)上市。一些中藥(如丹參)臨床上獲得了很好的療效,但很多篩選出的藥材實(shí)際應(yīng)用中不能達(dá)到滿意結(jié)果。因此需采用更合適的分析方法來(lái)比較,以篩選出最合適的藥材。本實(shí)驗(yàn)由于3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)(小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖抑制率、小鼠B16黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制率以及黑素合成抑制率)在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)重復(fù)性較差,誤差較大,經(jīng)多次重復(fù)淘汰異常值,最終確定3次的測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,這種情況進(jìn)行差異性檢驗(yàn)特別適合采用單因素兩兩間多重比較及可信區(qū)間重疊法。本試驗(yàn)以4味中藥乙醇提取物的4個(gè)質(zhì)量濃度作為獨(dú)立變量,共同按95%可信區(qū)間重疊法進(jìn)行差異性檢驗(yàn),這種統(tǒng)計(jì)分析方法能夠直觀、客觀、科學(xué)、正確地比較各組差異,對(duì)多組資料兩兩間比較的差異性檢驗(yàn)尤為合適。4味中藥乙醇提取物不同的質(zhì)量濃度之間祛黃褐斑作用(3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo))既沒(méi)有相關(guān)性,也沒(méi)有規(guī)律性,說(shuō)明每味中藥乙醇提取物只有在特定的質(zhì)量濃度時(shí)才有祛黃褐斑作用,在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí),將本試驗(yàn)3個(gè)指標(biāo)得出的結(jié)果再進(jìn)行比較,根據(jù)臨床試驗(yàn)結(jié)果綜合評(píng)價(jià),將能優(yōu)選出某種藥材及其含量,如500μg·mL-1白芨與125~250μg·mL-1白附子作用效果較好。因最終的選擇需進(jìn)行大樣本臨床試驗(yàn),本文所做的前期研究為臨床用藥量設(shè)計(jì)提供依據(jù),大樣本試驗(yàn)的內(nèi)容我們將另文發(fā)表。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),4味中藥