中藥顯微鑒定技術(shù)的研究進展

中藥顯微鑒定技術(shù)的研究進展

顯微鏡鑒定是指使用顯微鏡顯微鏡觀察材料的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形狀和含量的微觀特征，從而確定材料的品種和質(zhì)量。這是中醫(yī)識別的四種方法之一，具有簡單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點。由于藥材組織具有專屬性和穩(wěn)定性等特點,使得顯微鑒定在外形不易鑒定或已破損的藥材、粉末藥材及由原粉制成的中成藥研究中應(yīng)用尤其廣泛。2000年版《中國藥典》所收載的中藥制劑中有顯微鑒別項的達248種,約占55%,比1990年版增加69種,比1995年版增加33種,這種明顯的上升趨勢足以體現(xiàn)顯微鑒定在中藥鑒定中的重要作用。幾十年來,廣大藥學(xué)工作者在中藥顯微鑒定領(lǐng)域已發(fā)表了大量的研究論文,并出版了許多高質(zhì)量的研究專著,這些研究成果不僅提高了顯微鑒定的科研水平,也反映了顯微鑒定技術(shù)的快速發(fā)展。顯微鑒定的研究領(lǐng)域一直在不斷深化,時至今日,已經(jīng)不能單純用一臺普通光學(xué)顯微鏡來代表中藥的顯微鑒定了。筆者應(yīng)用各種檢索方法,對二十年來國內(nèi)顯微鑒定研究方法的相關(guān)報道進行了比較詳細(xì)的查閱,本文從顯微定性研究和顯微定量研究兩個方面對中藥顯微鑒定研究方法的發(fā)展概況作簡要介紹。1關(guān)于微定性研究顯微鑒定的主要研究方向是力圖通過對藥材的微觀顯微特征的觀察比較來鑒別藥材的真?zhèn)?、?yōu)劣。1.1在計算機數(shù)據(jù)處理中的應(yīng)用偏振光顯微鏡(簡稱偏光鏡)是利用了自然光在通過各向異性透明體時,可產(chǎn)生偏振光的作用原理,在普通光學(xué)顯微鏡中增加偏振裝置(價格低廉),使得偏振光線在通過各向同性的樣品時呈現(xiàn)暗視野,而各向異性的物質(zhì)呈現(xiàn)不同的色彩。通過普通顯微鏡和偏光鏡的對照觀察,可使中藥顯微鑒定的速度和準(zhǔn)確性大為提高,偏光鏡的應(yīng)用還為計算機圖像處理提供了方便。偏光鏡常用于淀粉和晶體物質(zhì)的觀察,趙中振等利用偏光鏡發(fā)現(xiàn)了黃芪等8種淀粉粒、人參等12種草酸鈣晶體、桃仁等7種石細(xì)胞、山茱萸等5種導(dǎo)管以及石菖蒲等8種纖維均具有穩(wěn)定、特異的偏光特征,并主要利用偏光鏡通過藥材的各自偏光特征鑒別了含34種藥材的至寶三鞭丸。在對具有偏光特征的藥材鑒定中應(yīng)用偏光鏡觀察可以快速、準(zhǔn)確地找到鑒定特征并能排除干擾,而許多藥材經(jīng)鑒定都具有偏光特征,筆者認(rèn)為應(yīng)該在顯微鑒定中普及偏光鏡的應(yīng)用。1.2化學(xué)成分鑒定研究普通光學(xué)顯微鏡因其經(jīng)濟適用,一直是顯微鑒定研究工作不可缺少的主要工具。可以說所有顯微研究的基礎(chǔ)工作都是通過使用普通光學(xué)顯微鏡來完成的,但多是直接觀察鏡下各組織的顯微形狀等特征,對顯微化學(xué)鑒定研究則相對較少。僅見王強等通過對樣品粉末分別滴加水合氯醛試液、濃硫酸試液及稀碘液后在鏡下觀察制片的顏色變化可以將所研究的6種香港市場牛黃商品完全區(qū)分;董書等利用對樣品粉末加間苯三酚和鹽酸染色后觀察導(dǎo)管和纖維的顏色變化可以區(qū)分升麻與腺毛馬藍(lán);劉葆琴等通過對藥材行微量升華后鏡下觀察升華結(jié)晶的形狀、顏色及分別滴加HCl、NaOH、FeCl3等化學(xué)試劑后觀察所見的化學(xué)反應(yīng)可以完全區(qū)分大黃等50種藥材;田恒康等通過對藥材提取液、藥材升華結(jié)晶、藥材自身分別進行顯微化學(xué)反應(yīng)得到肉桂等14種常用中藥材的顯微化學(xué)專屬性特征。這些研究方法簡便,易于觀察,均有很好的應(yīng)用價值。1.3顯微鑒定方法傳統(tǒng)的顯微鑒定多是在觀察藥材的鏡下特征后,通過顯微描繪器手工描繪所見特征記錄,這種方法難免使研究結(jié)果有人為的主觀誤差。近年來顯微攝影的應(yīng)用彌補了這一不足,利用相機拍攝得到的圖片可以真實反映觀察對象的各種鏡下特征。目前像OlympusBX50等將顯微鏡與相機連為一體的高級系統(tǒng)生物顯微鏡因其清晰度高,使用方便等優(yōu)點正在被逐步推廣使用。利用顯微攝影進行顯微鑒定研究的報道已比較多見。例如帥緋等對刺人參的根橫切面、縱切面的顯微觀察;許欣榮等對藥用月季花和玫瑰花的花萼、花柱的顯微觀察;丁小余等對鐵皮石斛莖解剖結(jié)構(gòu)的顯微觀察等均是利用高級系統(tǒng)生物顯微鏡進行顯微鑒定研究。但是顯微攝影的缺點是整體研究造價較高,難于在基層工作中普遍應(yīng)用。1.4掃描電鏡觀察普通光學(xué)顯微鏡的景深和視野的局限性決定其所觀察的樣品必須是極薄的切片或粉末,這常常給實際工作帶來許多不便之處。掃描電子顯微鏡的應(yīng)用基本上解決了這一難題。與普通光學(xué)顯微鏡相比,掃描電鏡具有直接觀察樣品表面結(jié)構(gòu)、景深大、放大范圍廣、分辨率高、樣品制備過程簡單等優(yōu)點。這些特點使其在觀察藥材表面細(xì)微特征方面更為適用,主要應(yīng)用于對藥材花粉粒、葉表面、種皮表面的鑒定研究?？低壤脪呙桦婄R對四種洋金花的花粉粒進行詳細(xì)觀察,發(fā)現(xiàn)白花曼陀羅與毛曼陀羅花粉粒在不規(guī)則網(wǎng)狀紋理的有無上,曼陀羅與紫花曼陀羅花粉粒在不規(guī)則網(wǎng)狀雕紋的大小上均有顯著區(qū)別,可作為鑒別參考。盧慧卿等在掃描電鏡下觀察到珍珠粉和珍珠層粉的文石小板形狀明顯不同,為兩者的鑒別提供了參考依據(jù)。另有報道在利用掃描電鏡觀察大多數(shù)單子葉植物中的晶體時發(fā)現(xiàn),長而多的針晶束先端部分的顯微特征是不同的,這對原植物的鑒定和生藥的研究具有一定的價值。掃描電鏡的應(yīng)用報道很多,在區(qū)分近緣屬植物的鑒定工作中正起著不可估量的作用。1.5特殊內(nèi)容的中藥鑒定技術(shù)圖像分析技術(shù)的應(yīng)用:計算機技術(shù)的發(fā)展及其在生藥學(xué)中的應(yīng)用,使中藥組織形態(tài)學(xué)研究逐漸向三維和定量方向發(fā)展。計算機圖像分析技術(shù)是運用體視學(xué)原理和計算機圖像測試技術(shù),測試大小、密度和形狀因子三大類參數(shù),并結(jié)合數(shù)值分類手段,定性定量地刻畫組織細(xì)胞顯微圖像的形態(tài)特征及評判標(biāo)準(zhǔn)的一種顯微鑒定手段。應(yīng)用圖像分析技術(shù)進行顯微鑒定研究尚不普遍,鄭漢臣等采用計算機圖像分析技術(shù)對榧屬植物的花粉進行了分析測定,得到了花粉最大面積、長軸、短軸、軸比、體積等三維形態(tài)學(xué)參數(shù),提示計算機圖像分析技術(shù)可用于建立生藥鑒定學(xué)方面的系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫。圖像分析技術(shù)有助于中藥顯微鑒定向人工智能化方向發(fā)展,并為近緣品種和混淆品種中藥鑒別提供了比較可靠的分析手段。但因其只是部分組織形態(tài)特征的定性定量描述,并且其本身技術(shù)規(guī)范性尚待進一步完善,所以只可作為中藥顯微鑒定的一種有效的輔助手段。圖像檢索技術(shù)的應(yīng)用:隨著電子計算機技術(shù)的快速發(fā)展,圖像檢索技術(shù)在中藥顯微鑒定研究中也被逐漸應(yīng)用?；谖谋镜膱D像檢索系統(tǒng)報道較多,這種圖像檢索的基本方法是通過建立圖文數(shù)據(jù)庫,選擇中藥組織特征建立代碼庫,鑒別時,輸入顯微組織的特征代碼,通過計算機檢索確定中藥物種及其圖文信息。其方法要求操作者要有較高的顯微鑒別技術(shù)水平,并且難以避免人為的主觀誤差,因此該系統(tǒng)的應(yīng)用有很多局限性。近10年來,基于內(nèi)容的圖像檢索系統(tǒng)的建設(shè)已有所進展,其基本原理是利用圖像顯示的形狀、輪廓、紋理和顏色等自身內(nèi)容,采用計算機圖像分析自動計算定量,形成圖像特征的量,計算機針對這些量與數(shù)據(jù)庫進行自動比較識別。這種方法可以彌補基于文本的圖像檢索系統(tǒng)的缺點,更有效地實現(xiàn)中藥顯微鑒別的自動化和智能化,更有利于普及顯微鑒定這一技術(shù)。2顯微定量測定顯微定量是根據(jù)顯微特征的專屬性和穩(wěn)定性,對藥材某一專屬特征進行計量分析,從而鑒定藥材的真?zhèn)?、?yōu)劣的方法。張瑜華,利用人參簇晶的顯微特征,對人參和西洋參的混懸液分別制片,鏡下觀察每片中簇晶數(shù)量,并確定簇晶數(shù)和含量間的回歸方程,經(jīng)t檢驗及相關(guān)性檢驗,均說明兩者簇品數(shù)有非常顯著差異,且回歸方程是顯著正相關(guān),據(jù)此鑒別人參與西洋參。陳家春等采用非參比物顯微定量法,分別測定藕節(jié)、牡丹皮、雞冠花、槐花炒炭前后所含顯微特征微粒的個數(shù),觀察炮制前后的變化,以此作為判斷該種中藥炒炭炮制品是否達到“炒炭存性”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的顯微定量的依據(jù)。顯微定量法適用于含明顯特征的各類中藥,方法科學(xué),操作簡便,完全適用于基層鑒定工作。3加快了顯微鑒定的自動化進程顯微鑒定的特點使其一直是鑒別藥材真?zhèn)巫钣行У氖侄沃?是其它鑒定手段不可替代的。隨著自然科學(xué)的飛速發(fā)展,數(shù)碼相機、掃描電鏡、電子計算機等高科技儀器的應(yīng)用正在與傳統(tǒng)的中藥顯微鑒定技術(shù)不斷融合,打破了顯微鑒定需要操作者有較高經(jīng)驗