第二章電生理研究方法2012.9.18

第二章心肌電生理學(xué)研究方法

MethodologyofMyocardiumElectrophysiologicalResearch

電生理學(xué)技術(shù)的發(fā)展1825年電流計發(fā)明與應(yīng)用1922年電子管放大器和陰極射線示波器問世20世紀(jì)40年代微電極技術(shù)產(chǎn)生動作電位的鈉學(xué)說20世紀(jì)50年代電壓鉗技術(shù)產(chǎn)生20世紀(jì)70年代膜片鉗技術(shù)謝靈頓(Sherrington)（1857-1952）英國神經(jīng)生物學(xué)家。發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)反射活動規(guī)律艾德里安(Adrian)（1889-1977）英國生理學(xué)家。闡明動作電位及其傳導(dǎo)規(guī)律1932年獲諾貝爾獎厄蘭格(Erlanger)（1874-1965）（美）兩人合作發(fā)明了陰極示波器，并研究了神經(jīng)纖維的功能加塞(Gasser)（1888-1963）（美）1944年獲諾貝爾獎Hermann變質(zhì)學(xué)說(Alterationtheory)。

1879年，他指出，在損傷的神經(jīng)或肌肉中所出現(xiàn)的負(fù)電位差，是發(fā)生于損傷一端的，后來進(jìn)一步證明了完全死亡的組織上是不產(chǎn)生這種負(fù)電位差的。這種正常部位與損傷部位之間的電位差，稱為損傷電位(injurypotential)這種電流則相應(yīng)地稱為損傷電流（injurycurrent）Hermann認(rèn)為，這種電流是損傷時才產(chǎn)生的。因此當(dāng)組織損傷時，在生理和化學(xué)作用的影響下產(chǎn)生了局部的變質(zhì)，因此與正常部位之間產(chǎn)生了電位差。Bernstein膜學(xué)說1902年，Bernstein提出生物電發(fā)生的膜學(xué)說：“神經(jīng)或肌肉的細(xì)胞膜只對鉀離子有特殊的通透性，而對較大的陽離子和陰離子則均無通透性，因此由于細(xì)胞內(nèi)外鉀離子分布不均勻，在膜兩側(cè)就形成一個電位差，此即靜息電位，神經(jīng)沖動到來時，膜變?yōu)闊o選擇通透的膜，靜息電位消失，動作電位因而產(chǎn)生?！?/p>

Hodgkin和Huxley離子學(xué)說（動作電位的鈉學(xué)說）

1940年前后，由于Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨軸突上發(fā)現(xiàn)動作電位大于靜息電位的事實，膜兩側(cè)溶液成分不同；膜對離子具有選擇性通透性，這種通透性在動作電位時發(fā)生改變。靜息時，對K+通透，興奮對Na+通透超過K+，通透性變化說明了神經(jīng)的電興奮，產(chǎn)生了離子學(xué)說（鈉學(xué)說）。Eccles1976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到乙酰膽堿（Acetylcholine,ACh）激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)（patchclamptechnique）；1980年Sigworth等獲得10-100GΩ的高阻封接（Gigaseal），1981年Hamill和Neher等對該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了全細(xì)胞記錄技術(shù)，從而使該技術(shù)更趨完善；1983年10月，《Single-ChannelRecording》一書的問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。

Neher

Sakmann（1944-）（1942-）（德國細(xì)胞生理學(xué)家）（德國細(xì)胞生理學(xué)家）

合作發(fā)明了膜片鉗技術(shù)，并應(yīng)用這一技術(shù)首次證實了細(xì)胞膜存在離子通道。這一成果對于研究細(xì)胞功能的調(diào)控至關(guān)重要，可揭示神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等多種疾病的發(fā)病機(jī)理，并提供治療的新途徑。二人共獲1991年諾貝爾獎。內(nèi)爾在實驗室進(jìn)行膜片箝研究工作

1983年10月第一版《Single-ChannelRecording》封面電生理獲醫(yī)學(xué)諾貝爾獎名單（截止到2002年）

第一節(jié)

常規(guī)心肌電生理研究技術(shù)

在常規(guī)心肌電生理研究中，主要是采用玻璃微電極插入在體或離體心肌細(xì)胞內(nèi)，記錄心肌細(xì)胞的跨膜電活動，并研究各種因素對其電活動的影響。一、常用電生理儀器

刺激系統(tǒng)（刺激器等）檢測系統(tǒng)（電極、換能器）放大系統(tǒng)（前置、后置放大器）記錄顯示系統(tǒng)(示波器、記錄儀、計算機(jī)）1.電子刺激器（Electronicstimulator）

電刺激不易損傷組織，又能定量而準(zhǔn)確地重復(fù)使用。方波（矩形波，squarewave）的幅度、波寬和頻率都可分別進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以矩形波電子刺激器可作為理想的刺激源。SEN-7203方波刺激脈沖的參數(shù)要求：（1）

幅度（強(qiáng)度，amplitude）矩形脈沖電壓的最大瞬時值

（2）波寬（刺激持續(xù)時間time）（3）頻率（frequency）

一個脈沖循環(huán)所需的時間為周期，周期的倒數(shù)（即1S內(nèi)所含的周期數(shù)目）稱為頻率（4）延遲（Delay）從觸發(fā)脈沖到刺激方波的出現(xiàn)，這一段時間稱為延遲。（5）刺激方式（Patternofstimulation）單刺激、連續(xù)刺激、雙脈沖刺激（6）同步輸出（Synchronizedoutput）同步脈沖表示一次刺激的時間起點（7）刺激隔離器（Isolator）

當(dāng)對實驗動物同時進(jìn)行刺激和記錄生物電時，刺激器輸出和放大器輸入具有公共接地線，使得一部分刺激電流流入放大器的輸入端，使記錄器記錄到一個刺激電流產(chǎn)生的波形，即刺激偽跡。隔離器切斷了刺激電流從公共地線返回的可能，減小偽跡并與電位分開。同時，消除50周交流電感應(yīng)造成的干擾。2.微電極放大器（microelectrodeamplifier）

組成：精密穩(wěn)壓電源、高輸入阻抗探頭、主放大器、電容補(bǔ)償電路、校正電路、低通濾波電路等Axopatch200B（AXON，USA）

Fastmagnitude,Fasttimeconstant（τ）鈕Slowmagnitude,Slowtimeconstant（τ）鈕WHOLE-CELLCAP鈕要求：（1）足夠高的放大能力（2）頻率響應(yīng)范圍大0—100Hz（3）低噪聲>50uV（4）高的辨差比（共模抑制比）1000:1（5）高輸入阻抗1000MΩ（6）低頻與高頻濾波低頻濾波----用于變化速度快的生物電變化高頻濾波----用于減少噪聲，提高信噪比3示波器（oscillograph）要求：高靈敏度掃描速度快頻率高類型：雙線示波器多線示波器長余輝慢掃描示波器記憶示波器VC-114貯存和分析電生理實驗結(jié)果的儀器（1）示波照相機(jī)（2）磁帶記錄儀（3）電子計算機(jī)A/D轉(zhuǎn)換--把生物電（模擬）信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號D/A轉(zhuǎn)換--把數(shù)字信號轉(zhuǎn)換成模擬信號二細(xì)胞外記錄（Extracellularrecording）細(xì)胞外記錄是把電極安放在心肌表面或附近引導(dǎo)心肌組織或細(xì)胞的電活動。適應(yīng)范圍：（1）長時間的實驗；（2）對清醒的、能自由活動的動物研究；（3）從不同組織部位作同時的多導(dǎo)記錄；（4）研究非常小的細(xì)胞，數(shù)量多而難于孤立起來，接觸和穿刺都易于損傷等；（5）研究器官的總的活動。電極：（1）玻璃微電極（2）金屬電極（3）離子選擇性電極（4）單極電極（5）多管電極三在體心臟電活動的細(xì)胞內(nèi)記錄（intracellularrecordinginsitu）實驗裝置包括浮置式玻璃微電極、微電極推進(jìn)器、微電極放大器、示波器、照相裝置、記錄儀、計算機(jī)等推進(jìn)器微放器示波器監(jiān)聽器照相機(jī)記錄儀計算機(jī)打印機(jī)微電極心臟

動物手術(shù)電極制作要求插入應(yīng)用范圍生理、藥理、心肌缺血等

優(yōu)點：在近于生理狀態(tài)下實驗，可觀察整體因素對心肌電活動的影響，可研究藥物及其代謝產(chǎn)物的作用過程，更有利于闡明各種調(diào)節(jié)因素、致病因素或藥物對心肌電生理特性的影響機(jī)制缺點：記錄不持久，影響因素多四離體心肌電活動的細(xì)胞內(nèi)記錄（intracellularrecordinginvitro）1實驗裝置2微電極、標(biāo)準(zhǔn)微電極、微推進(jìn)器3浴槽與灌流裝置生理鹽溶液、混合氣體、攝氏30—37度4刺激器5應(yīng)用范圍優(yōu)點穩(wěn)定、長時間記錄，可任意改變?nèi)芤撼煞?觀察指標(biāo)

RP,APA,APD10,APD50,APD90,Vmax第二節(jié)：電壓鉗制技術(shù)(Voltageclamptechnique)

利用微電極技術(shù)，雖然記錄到細(xì)胞內(nèi)的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機(jī)制，必需應(yīng)用電壓鉗制技術(shù)。這一技術(shù)首先是由Cole及其同事設(shè)計，在經(jīng)Hodgkin等人加以改進(jìn)，用于神經(jīng)電生理研究，弄清了神經(jīng)纖維在興奮時離子流的情況。

一、細(xì)胞膜的生物物理特性(Biophysicalpropertiesofcellmembrane)

細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成。以脂質(zhì)雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質(zhì)顆粒。細(xì)胞膜的電緊張及其擴(kuò)布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細(xì)胞膜電纜性質(zhì)(cableproperties)的反映。(軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時間上的延緩作用――神經(jīng)的“電纜”性質(zhì))。細(xì)胞膜的電纜特性從定的等效電路及其時間常數(shù)和空間常數(shù)得到證實。(一)細(xì)胞膜的等效電路

從電學(xué)特點上分析，細(xì)胞膜可等效地模擬為電阻－電容器。它具備細(xì)胞漿電阻（縱向電