胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)

胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)

(一)胚胎干細(xì)胞的來源現(xiàn)在胚胎干細(xì)胞的重要來源有：①囊胚的ICM及受精卵發(fā)育至桑葚胚之前的早期胚胎細(xì)胞；②從胚胎生殖嵴及腸系膜中分離原始生殖細(xì)胞PGCs后培養(yǎng)建系的胚胎生殖細(xì)胞(embryonicgermcells，EG細(xì)胞)，也含有ESCs的特性，能夠分化為多個類型的成熟細(xì)胞；③體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(somaticcellnucleartransplantation，SCNT)至去核卵母細(xì)胞后哺育出來的全能細(xì)胞。其中囊胚的ICM最為慣用。(二)胚胎干細(xì)胞的分離1.分離獲取ESCs的時間：以既確保ESCs的全能性又要有足夠的細(xì)胞數(shù)量為原則來擬定ESCs分離獲取的最佳時間。以ICM為ESCs來源時：小鼠取3～5天囊胚；豬取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES細(xì)胞時：小鼠取12.5天胎兒生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚層組織塊、12.5天背腸系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎兒生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。2.分離獲取ESCs的辦法：從PGCs分離ESCs的辦法常為機(jī)械剪切與消化相結(jié)正當(dāng)，即把采用的胚胎組織充足剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。從囊胚分離ICM的辦法重要有三種：(1)免疫外科學(xué)辦法：體外培養(yǎng)的小鼠胚泡去除透明帶后，經(jīng)兔抗JCR小鼠脾臟細(xì)胞抗血清(抗H-26)作用30分鐘，移至1∶6稀釋的新鮮豚鼠血清中作用30分鐘，Hank’s液沖洗，此時胚泡的滋養(yǎng)外胚層呈空泡狀，用眼科手術(shù)刀挑去死了的滋養(yǎng)層細(xì)胞，留存ICM細(xì)胞用于培養(yǎng)。這種辦法運用囊胚腔對抗體的不通透性，通過抗體、補(bǔ)體結(jié)合對細(xì)胞的毒性殺傷作用，去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，保存ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。(2)組織培養(yǎng)法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，予以外源激素，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，但延緩著床，4～6天后，由子宮沖取胚泡進(jìn)行培養(yǎng)。成果滋養(yǎng)層細(xì)胞生長并推開喂養(yǎng)層細(xì)胞，在培養(yǎng)皿底壁上鋪展；而ICM細(xì)胞增殖，垂直向上生長，形成卵圓柱狀構(gòu)造，在顯微鏡下用細(xì)玻璃針挑出這種柱狀構(gòu)造，消化傳代。Evans和Kaufman采用這種辦法第一種建立了小鼠ESCs系。(3)顯微外科學(xué)辦法：小鼠受精后3～4天，由子宮沖取胚泡，運用顯微操作系統(tǒng)直接從胚泡中吸出ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于免疫外科學(xué)辦法需要特殊的試劑去除透明帶和滋養(yǎng)層，易對內(nèi)細(xì)胞群造成損傷，而顯微外科學(xué)辦法需要專門的儀器設(shè)備，且對人員的技術(shù)水平規(guī)定較高，均難以推廣應(yīng)用。組織培養(yǎng)法將胚泡接種在喂養(yǎng)層上，模擬體內(nèi)胚泡的著床，更靠近自然發(fā)育過程，內(nèi)細(xì)胞群增殖旺盛，較易獲得胚胎干細(xì)胞樣集落。(三)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和建系ESCs的分離培養(yǎng)和建系是其得以應(yīng)用的前提。ESCs建系的原理是：將分離獲取的ICM或PGCs與喂養(yǎng)層共同培養(yǎng)，使之增殖而又保持其未分化狀態(tài)，這樣代代相傳從而使ESCs成千上萬的克隆?，F(xiàn)在建立ESCs系的辦法有多個，慣用辦法涉及下列過程：①原始ESCs的獲得：從受孕動物體內(nèi)或體外受精卵培養(yǎng)中獲得發(fā)育至桑葚胚或胚泡階段的早期胚胎，用機(jī)械法分離、胰酶或膠原酶消化桑葚胚或胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)得到原始ESCs懸液。②ESCs的傳代培養(yǎng)：將原始ESCs懸液接種到經(jīng)放射線照射或絲裂霉素C解決的成纖維細(xì)胞喂養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)1周左右，發(fā)現(xiàn)典型的ESCs集落，挑取細(xì)胞集落，用低濃度胰酶分散后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，3～5天傳1次。經(jīng)重復(fù)傳代培養(yǎng)，可獲得生長旺盛的高純度ESCs。③ESCs的鑒定。由于ESCs來源于分裂增殖非常活躍的早期胚胎細(xì)胞，因此維持其生長代謝所需的營養(yǎng)要充足，用于ESCs培養(yǎng)的喂養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基含高糖和谷氨酰胺，同時加胎牛血清、新生牛血清、2-巰基乙醇。高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同時提供喂養(yǎng)層細(xì)胞生長所需的能量；谷氨酰胺作為細(xì)胞合成蛋白質(zhì)與核酸的原料，是喂養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基的必需品；2-巰基乙醇的作用為增進(jìn)胚胎細(xì)胞的分裂增殖，并可還原血清中的含硫化合物，避免過氧化物對ESCs的損害。1.胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)體系：(1)常規(guī)培養(yǎng)液：選擇和配制高質(zhì)量的培養(yǎng)基是體外培養(yǎng)ESCs的基本規(guī)定。慣用的培養(yǎng)基有MEM-α、DMEM、TCM-199、F12等合成培養(yǎng)基，以DMEM應(yīng)用最為普遍。再加入10%新生牛血清、10%胎牛血清、0.1mM2-巰基乙醇、100μg/mlL-谷氨酰胺。Thomson等建立恒河猴(rhesusmonkey)ESCs系時，培養(yǎng)基中補(bǔ)加了1%的非必需氨基酸，成果ESCs生長良好。Gardner和Lane發(fā)現(xiàn)，如果培養(yǎng)基中含有輸卵管液中高濃度體現(xiàn)的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均明顯增加。(2)無血清培養(yǎng)基：血清中含有大量促細(xì)胞生長因子和多個營養(yǎng)物質(zhì)，有增進(jìn)細(xì)胞生長繁殖和黏附的作用，但血清中還含有許多未知的成分和某些分化誘導(dǎo)因子，不利于ESCs未分化狀態(tài)的維持。為此人們嘗試使用無血清培養(yǎng)液、化學(xué)合成培養(yǎng)液(chemicallydefinedmedium)進(jìn)行ESCs的培養(yǎng)，加入刺激細(xì)胞生長的激素、細(xì)胞因子等，發(fā)現(xiàn)ESCs增殖旺盛，且能保持未分化狀態(tài)。(3)條件培養(yǎng)基(conditionedmedium，CM)：Martin曾應(yīng)用小鼠畸胎瘤多能干細(xì)胞系PSA-1的條件培養(yǎng)基建立了小鼠ESCs系，后Axelrod對其進(jìn)行了改良：將PSA-1畸胎瘤細(xì)胞接種于STO喂養(yǎng)層上，在含有10%胎牛血清的DMEM中貼壁培養(yǎng)，達(dá)成50%～75%匯合時更換培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基(加有10mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10mg/ml胰島素)繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)液，離心，去除細(xì)胞沉淀，上清液再通過0.22μm的微孔濾膜過濾，過濾后的PSA-1培養(yǎng)液再加入10%胎牛血清、0.1mM2-巰基乙醇，即為PSA-1條件培養(yǎng)基。使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基稀釋，PSA-1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子等活性物質(zhì)的活性基本保持不變。后來許多實驗室制備了不同的條件培養(yǎng)基取代喂養(yǎng)層細(xì)胞來維持ESCs的生長，如BRL(buffaloratlivercells)、PC10-6R轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞、HBC-5637(5637humanbladdercarcinomacells)、RH-CM(大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基)等，這些條件培養(yǎng)基中都含有高濃度的細(xì)胞分化克制因子，能夠克制ESCs的分化。(4)喂養(yǎng)層(feederlayer)：喂養(yǎng)層是一層通過射線照射或絲裂霉素C解決后用作培養(yǎng)ESCs的底物細(xì)胞層。喂養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)射線照射或絲裂霉素C解決后，即使失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培養(yǎng)液的能力，為胚胎發(fā)育提供某些必需因子，如成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子等促有絲分裂因子，LIF等細(xì)胞分化克制因子，增進(jìn)其增殖，克制其分化，并且能夠除去體外培養(yǎng)環(huán)境中的毒素?，F(xiàn)在慣用的喂養(yǎng)層有：STO、PMEF(primarymouseembryonicfibroblast)、SNL(G418R基因和LIF基因轉(zhuǎn)染的STO)、HBC-5637等。其中PMEF以其易于取材、抑分化效果好等特點而被廣泛應(yīng)用。制備喂養(yǎng)層時，取達(dá)成80%匯合的原代鼠胚成纖維細(xì)胞，加入含10μg/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)液，作用2～4小時后，棄去培養(yǎng)液，用無Ca2+、Mg2+的Hank’s液洗滌培養(yǎng)細(xì)胞4～5次后，0.125%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化制成細(xì)胞懸液，接種在涂有0.1%明膠的四孔板中。安立龍等將小鼠ESCs置于衰老喂養(yǎng)層表面進(jìn)行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，ESC集落松散，表面及周邊形成許多顆粒細(xì)胞、巨型細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞，認(rèn)為衰老喂養(yǎng)層能誘導(dǎo)小鼠ESCs的體外分化，因此建議使用新鮮制備的喂養(yǎng)層細(xì)胞來分離培養(yǎng)ESCs。2.胚胎干細(xì)胞的獲取：(1)早期胚胎細(xì)胞培養(yǎng)法：早期胚胎細(xì)胞培養(yǎng)法是將致密桑葚胚用0.3%EDTA將其離散為卵裂球，并單個培養(yǎng)在STO(原代胎兒成纖維細(xì)胞)喂養(yǎng)層上，在培養(yǎng)48～72小時后，出現(xiàn)ESCs集落。(2)胚胎與喂養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法：將早期胚胎如桑葚胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚等放置在鋪有STO或3T3喂養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待胚胎貼壁、透明帶脫落、ICM附著增生，出現(xiàn)鳥巢狀集落時，挑出ICM，消化ICM為細(xì)胞小塊，用等體積培養(yǎng)液或胎牛血清中和胰蛋白酶作用，將細(xì)胞小塊接種在新喂養(yǎng)層上培養(yǎng)，就會獲得ESCs。(3)ICM與喂養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法：用免疫外科手術(shù)法剝除滋養(yǎng)層細(xì)胞，以STO細(xì)胞為喂養(yǎng)層，用ESCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)ICM細(xì)胞，也可獲得ESCs，剝除滋養(yǎng)層的重要目的是避免滋養(yǎng)層細(xì)胞對ICM細(xì)胞的競爭克制和誘導(dǎo)分化。(4)原始生殖細(xì)胞與喂養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法：將原始生殖細(xì)胞PGCs接種于STO喂養(yǎng)層細(xì)胞表面，可獲得人ESCs。從人流產(chǎn)胎兒生殖嵴分離和克隆人ES細(xì)胞，克服了實驗材料難以獲得的困難，這將會增進(jìn)與人ESCs有關(guān)研究的進(jìn)行。(5)裸胚與喂養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)：用玻璃針刺破囊胚或桑葚胚透明帶，將有破口透明帶的胚胎置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，次日，ICM就從透明帶中脫出貼附于喂養(yǎng)層。透明帶結(jié)實、厚、不易破裂的動物胚胎貼壁緩慢，影響ICM增殖，切除透明帶，有助于ICM增殖和ESCs形成。而透明帶薄，易于破裂的胚胎貼壁不受影響，切除透明帶等操作對ICM有不利影響，使ESCs形成率減少。(6)熱休克解決胚胎與喂養(yǎng)層共培養(yǎng)：當(dāng)胚胎在體內(nèi)發(fā)育至2細(xì)胞或桑葚胚時，從子宮中取2細(xì)胞胚胎或桑葚胚，將胚胎置于41℃持續(xù)1小時，增加胚胎ICM細(xì)胞。采用熱休克解決胚胎，桑葚胚發(fā)育至孵化胚的效率為87%，2細(xì)胞胚胎發(fā)育至囊胚的比率為85.0%。在胚胎分裂的活躍期用熱應(yīng)激解決胚胎，阻制了胚胎分化，擴(kuò)大了ESCs分離的時間范疇。(7)切割胚胎培養(yǎng)：對早期胚胎進(jìn)行切割，使胚胎一分為二。若2個半胚均含有ICM和滋養(yǎng)層細(xì)胞，半胚可發(fā)育為擴(kuò)大囊胚，大概有35%的半胚可貼附于子宮成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層，且對后來的胚胎和胎兒發(fā)育無影響。這表明，用切割半胚能夠分離ICM和ESCs。(四)小鼠胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的實驗室技術(shù)由于ESCs在普通體外培養(yǎng)條件極易分化而失去其多潛能性特點，故需掌握一定的培養(yǎng)技術(shù)才干保存其多向分化潛能和體外擴(kuò)增兩大特點?，F(xiàn)在，以小鼠ESCs體外培養(yǎng)技術(shù)最為成熟，本文將以小鼠ESCs為例，介紹ESCs體外培養(yǎng)和ESCs分離鑒定等實驗技術(shù)。1.培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：(1)ESCs培養(yǎng)液：以DMEM(高糖，葡萄糖含量要在4.5g/L以上)為基礎(chǔ)液，加入下列成分：NaHCO32.2g/L谷氨酰胺2mM非必需氨基酸0.1mMβ-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)0.1mM或單硫甘油(monothioglycerol)0.15mM慶大霉素50μg/ml或青、鏈霉素各100IU/ml(必要時可不加抗生素)15%胎牛血清(FBS)或10%胎牛血清+10%新生牛血清(NBS)LIF(leukemiainhibitoryfactor)，可選擇性加入，用喂養(yǎng)層細(xì)胞喂養(yǎng)ES細(xì)胞時，能夠不加，或加入500～1000IU/ml，無喂養(yǎng)層細(xì)胞喂養(yǎng)時要加1000IU/ml以上。用超純水或五蒸水配制，用HCl調(diào)pH7.4，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩，F(xiàn)在GIBCO公司生產(chǎn)了一種KD-SRES細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，可替代以上培養(yǎng)液使用。(2)STO及MEFs細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM(含葡萄糖1.0g/L即可)，10%新生牛血清，青、鏈霉素各100IU/ml(或慶大霉素50μg/ml)，三蒸水配制，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?3)胚胎培養(yǎng)液：M16或DMEM(高糖)+10%NBS+10%FCS+青、鏈霉素各100IU/ml。(4)消化液：為胰蛋白酶-EDTA溶液。胰蛋白酶干粉1.25gEDTA0.2gNaCl7.0gNa2HPO4·12H2O0.3g(或NaHPO4·7H2O0.18g)KH2PO40.24gKCL0.37gTris3.0gD-葡萄糖1.0g慶大霉素4萬IU(或青、鏈霉素各10萬IU)五蒸水或超純水1000ml過濾除菌，0℃保存?zhèn)溆谩?5)沖卵液：無Ca2+、Mg2+的PBS+10%新生牛血清+青、鏈霉素各100IU/ml。(6)絲裂霉素C：STO及MEFs細(xì)胞培養(yǎng)液加入絲裂霉素C10μg/ml，用前配制，4℃保存，不超出1周，避光。(7)孕馬血清(PMSG)及絨毛膜促性腺激素(hCG)：用單蒸水配成濃度PMSG50IU/ml、hCG100IU/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?8)凍存液：MEFs和STO及ES細(xì)胞培養(yǎng)液+10%～15%的二甲基亞砜(DMSO)，用時配制或配制后冰凍備用。(9)PBS緩沖液：使用超純水或五蒸水配制，高壓滅菌或過濾除菌。2.ESCs的培養(yǎng)：由于ESCs在體外培養(yǎng)過程中極易分化，故既要保持其不停增殖又要克制其分化，則必須將其喂養(yǎng)在能分泌克制因子的喂養(yǎng)細(xì)胞單層上或在培養(yǎng)基中加入分化克制因子。ESCs的培養(yǎng)涉及喂養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)、喂養(yǎng)單層制備及ESCs培養(yǎng)三部分工作。(1)喂養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：現(xiàn)在喂養(yǎng)細(xì)胞有兩大類：MEFs(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)和STO(小鼠纖維母細(xì)胞株)及已經(jīng)穩(wěn)定體現(xiàn)了白血病克制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)和neoγ的STO細(xì)胞(如SNL細(xì)胞)。MEFs的制備和培養(yǎng)：①性成熟雌小鼠(7～8周齡)與種雄鼠(8周齡以上)1∶2比例合籠，每天早上觀察雌小鼠陰道口，有乳白色或淡黃色膠凍狀物(陰道栓)即擬定為懷孕，見栓當(dāng)天為懷孕0.5天。②取懷孕12.5～14.5天的雌鼠，脫臼處死，無菌條件下暴露子宮，鑷住近子宮頸端分離子宮系膜，剪斷子宮角，提起整個子宮，在滅菌濾紙上吸干血跡，置入盛有PBS或無血清DMEM平皿內(nèi)。③沿子宮系膜側(cè)剪開子宮，摘取胚胎，置入另一盛有PBS或無血清DMEM平皿內(nèi)充足洗滌，去除殘存血跡。④用小鑷子撕破胎膜，取出鼠胚，去除胚胎頭部、內(nèi)臟、四肢及尾部，將軀干置入另一盛有PBS或無血清DMEM平皿內(nèi)，最少洗滌3次，完全去除紅細(xì)胞。⑤用滅菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪(切)成1mm下列的碎塊，吸至離心管內(nèi)。⑥加入等體積胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕吸吹30秒，制成單細(xì)胞懸液。⑦加入等體積MEFs培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用，800～1000r/min離心5分鐘，棄上清液。加入5ml左右鼠胚細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)(5個鼠胚可使用1個100～150ml培養(yǎng)瓶)讓細(xì)胞懸液能均勻覆蓋培養(yǎng)瓶表面(培養(yǎng)液不適宜過多)，37℃、5%CO2、100%濕度孵箱培養(yǎng)。⑧開始培養(yǎng)的前2天不要晃動培養(yǎng)瓶，第3天細(xì)胞附著于培養(yǎng)瓶底壁，開始生長，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。⑨第4～5天，細(xì)胞連成一片，即可消化制成細(xì)胞懸液，置離心管內(nèi)靜置5～10分鐘，取上清液即為單細(xì)胞懸液，以1∶3比例傳代，普通采用3～5代MEFs作喂養(yǎng)細(xì)胞用。⑩也能夠?qū)⑹笈哕|干組織碎塊收集于離心管后重復(fù)下列操作5～6次：加入等體積消化液輕輕吹吸30秒→加入等體積培養(yǎng)液終止消化→靜置3～5分鐘→收集上層單細(xì)胞懸液。最后棄大塊組織，將收集到的單細(xì)胞懸液離心，800～1000r/min離心5分鐘，棄上清液，加入培養(yǎng)液分裝至培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5%CO2、100%濕度孵箱培養(yǎng)。每天觀察，及時更換培養(yǎng)液和傳代，同樣以1∶3比例傳代，3～5代作喂養(yǎng)細(xì)胞用。STO細(xì)胞的培養(yǎng)：STO細(xì)胞是SIM小鼠纖維母細(xì)胞的一種耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系細(xì)胞，廣泛用作多潛能畸胎瘤細(xì)胞和ES細(xì)胞的喂養(yǎng)細(xì)胞，其替代MEFs的優(yōu)點是：細(xì)胞易于生長及不需要經(jīng)常準(zhǔn)備孕鼠，但是STO細(xì)胞必須保持在最適生長條件下，否則易于變異，特別是生長密度過大時?，F(xiàn)在已有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了neoγ基因和LIF基因的STO細(xì)胞株(如SNL細(xì)胞)，可用于ESCs的轉(zhuǎn)染和篩選。STO細(xì)胞的培養(yǎng)按普通細(xì)胞株的培養(yǎng)辦法即可，培養(yǎng)液與MEFs相似。(2)喂養(yǎng)單層制備：有兩種辦法，絲裂霉素解決法和γ射線照射法。一定劑量的絲裂霉素和γ射線能夠使細(xì)胞停止分裂，但又保持生存，并分泌克制ESCs分化和增進(jìn)ESCs增殖的因子，確保ESCs的生長。絲裂霉素解決法：①MEFs或STO細(xì)胞融合成單層，棄培養(yǎng)液，加入含10μg/ml絲裂霉素C溶液(覆蓋細(xì)胞單層即可)，37℃、5%CO2、100%濕度孵箱內(nèi)放置2～3小時。②吸棄絲裂霉素解決液，用PBS充足洗滌3～5次，除去殘存絲裂霉素C，因其能影響ESCs的生長。③用消化液將其消化成單細(xì)胞懸液，接種到預(yù)先用多聚賴氨酸解決過的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)(多聚賴氨酸覆蓋培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿表面，室溫放置2小時以上，用前吸棄多出多聚賴氨酸，直接使用或稍干燥后使用)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為每毫升3×105個。④37℃、5%CO2、100%濕度孵箱培養(yǎng)，細(xì)胞很快貼壁并鋪展為單層。細(xì)胞如果過稀可補(bǔ)加絲裂霉素解決過的細(xì)胞，這樣制成的喂養(yǎng)單層可使用6～10天，用前更換ESCs培養(yǎng)液。⑤MEFS或STO細(xì)胞單層用絲裂霉素解決及PBS洗滌后來，也能夠不消化直接使用。γ-射線解決法：①MEFS或STO融合成單層后，用γ射線照射，劑量為30～100Gy(3000～10000rad)。②余下環(huán)節(jié)同絲裂霉素C解決法。③照射過的細(xì)胞也能夠以每毫升5×106個濃度凍存?zhèn)溆谩?3)從小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離培養(yǎng)原代ESCs：孕鼠的準(zhǔn)備及胚胎的采集：①性成熟前期雌鼠(昆明鼠大概4周，24～26g最佳)于11∶00～1∶00或下午4∶00～6∶00腹腔注射HMG5～10IU/只。②46～48小時后腹腔內(nèi)注射hCG5～10IU/只，同時以1∶1比例與種雄鼠合籠。③第2天上午觀察雌鼠陰道栓，見栓者當(dāng)天為懷孕0.5天。④懷孕3.5天(即見栓第4天)雌鼠脫臼處死，無菌條件下打開腹腔，暴露子宮。⑤鑷住近子宮頸端，剪斷，分離子宮系膜，并于輸卵管端剪斷子宮角。⑥小鼠為雙角子宮，分離后的子宮用無菌濾紙吸干血跡后置于無菌平皿內(nèi)(直徑35mm)。⑦5ml滅菌注射器(平頭)吸入沖卵液，從子宮角端進(jìn)針，針頭要確保進(jìn)入子宮腔內(nèi)，將沖卵液快速推入子宮腔(每側(cè)子宮0.2～0.5ml)，胚胎連同沖卵液從子宮頸端排出，要注意用平皿接好排出的沖卵液。⑧將盛有胚胎沖卵液的平皿置于顯微鏡下(50～100倍)，認(rèn)真采集胚胎。3.5天胚胎處在囊胚期，但也可能處在桑葚胚期，均可使用。胚胎培養(yǎng)：①用胚胎培養(yǎng)液在直徑35mm平皿中做成小滴，每個直徑35mm平皿可做成4個小滴，上覆蓋透明石蠟油。②收集的3.5天胚胎置入培養(yǎng)小滴內(nèi)，37℃、5%CO2、100%濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。③每天觀察，換液每日1～2次。④待胚胎發(fā)育為囊腔充足擴(kuò)展或突破透明帶時移植到MEFs或STO喂養(yǎng)單層(用直徑35mm培養(yǎng)皿準(zhǔn)備，上覆蓋透明石蠟油)上繼續(xù)培養(yǎng)，此時換上DMEM(高糖)培養(yǎng)液(加10%新生牛血清、10%胎牛血清和雙抗)。⑤1～2天后，胚胎貼附在喂養(yǎng)單層上，滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)展成薄薄一層，將喂養(yǎng)細(xì)胞推開，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位于中央向上隆起生長，邊沿界限清晰，表面較光滑，構(gòu)造致密，3～5天后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增大，即可做內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離和早期培養(yǎng)。此期隔日半量換液。(4)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞分離培養(yǎng)：①毛細(xì)吸管的準(zhǔn)備：將18cm巴氏德吸管在火焰上拉細(xì)，用砂輪切斷末端，準(zhǔn)備末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)稍大或稍小兩種。②將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)生長良好的培養(yǎng)皿置于顯微鏡下(50～100倍)，用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)稍大的毛細(xì)吸管挑起內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，收集到覆蓋有透明石蠟油的培養(yǎng)小滴內(nèi)(用胚胎培養(yǎng)時相似的培養(yǎng)液制備)。③將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)收集齊后，一同置于覆蓋有透明石蠟油的胰蛋白酶-EDTA消化液小滴內(nèi)，用消化液洗滌1次，棄除殘存培養(yǎng)液，加入新的消化液，37℃作用3～4分鐘。④改用末端口徑比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)稍小的毛細(xì)吸管，輕輕吸吹內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊，至分散成2～4個細(xì)胞在一起的小團(tuán)塊。⑤將含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的消化小滴吸至MEFs或STO喂養(yǎng)單層上(預(yù)先用絲裂霉素C或γ射線解決)，換上ES細(xì)胞培養(yǎng)液。⑥每天觀察，2天后可見ESCs樣細(xì)胞小集落出現(xiàn)，3～4天集落進(jìn)一步增大，6～7天可按ES細(xì)胞培養(yǎng)辦法進(jìn)行消化傳代。(5)ESCs的培養(yǎng)：喂養(yǎng)層培養(yǎng)法：①將ESCs種植到用絲裂霉素C解決或γ射線照射后制成的喂養(yǎng)單層上，換上ESCs培養(yǎng)液。②37℃、5%CO2、100%濕度孵箱培養(yǎng)，每天觀察，及時更換培養(yǎng)液，每2～3天以1∶3至1∶6的比例傳代。③消化時，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，以能覆蓋細(xì)胞表面為度，作用30秒，棄消化液，讓殘存消化液繼續(xù)作用，輕敲培養(yǎng)皿底部，細(xì)胞層出現(xiàn)裂隙，細(xì)胞紛紛脫落時，加入ESCs培養(yǎng)液，輕輕吹打至成單細(xì)胞懸液。④正常的ESCs集落邊沿清晰、表面平滑、構(gòu)造致密、隆起生長、堿性磷酸酶檢查強(qiáng)陽性。若喂養(yǎng)條件不適，ESCs易于分化，集落變得扁平，邊沿不清晰，表面粗糙，見有較大內(nèi)胚層樣構(gòu)造，堿性磷酸酶檢查陰性。無喂養(yǎng)層培養(yǎng)法：①LIF的使用：于ESCs培養(yǎng)液中加入LIF，濃度1000IU/ml即可在無喂養(yǎng)層的狀況下培養(yǎng)ESCs。②Buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRL)條件培養(yǎng)基(BRL-CM)的使用：BRL是一種細(xì)胞株，能分泌LIF，故收集其上清液可用于ESCs的培養(yǎng)。辦法是：以2×105個/ml濃度種植細(xì)胞，培養(yǎng)72小時，收集上清液，使用的培養(yǎng)液為不加LIF的ESCs培養(yǎng)液。培養(yǎng)上清液使用前過濾棄細(xì)胞碎片。使用時，6～7份培養(yǎng)上清液加3～4份新鮮不加LIF的ESCs培養(yǎng)液，再加入8%～10%的胎牛血清，組合成BRL-CM培養(yǎng)基，培養(yǎng)ESCs時不加喂養(yǎng)層，同LIF同樣可保持ESCs未分化狀態(tài)和多向分化潛能。③大鼠心肌條件培養(yǎng)基(RH-CM)的使用：2～3周齡大鼠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液也有BRL培養(yǎng)上清液類似的作用。辦法是：將2～3周齡的大鼠心肌制成單層細(xì)胞，以1∶2傳代，收集5代內(nèi)的培養(yǎng)上清液。所用的培養(yǎng)液為不加LIF的ESCs培養(yǎng)液。培養(yǎng)上清液使用前過濾棄細(xì)胞碎片，使用時6份培養(yǎng)上清液加3份新鮮不加LIF的ESCs培養(yǎng)液，再加1份胎牛血清，組合成RH-CM。④無喂養(yǎng)層培養(yǎng)的ESCs，呈島嶼狀生長，克隆的特性性形態(tài)更清晰。3.ESCs的凍存與復(fù)蘇：由于胚胎干細(xì)胞來源較少，這就需要通過體外擴(kuò)增以獲得足夠數(shù)量的胚胎干細(xì)胞。但是在長久的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，可能會出現(xiàn)微生物污染或基因型變化等狀況，從而造成含有優(yōu)良特性的細(xì)胞系丟失，為避免干細(xì)胞丟失，胚胎干細(xì)胞在體外的合理冷凍與復(fù)蘇并無限期保存將成為核心。如需要將ESCs冷凍，最佳在培養(yǎng)早期進(jìn)行，選擇細(xì)胞形態(tài)及核型均正常的細(xì)胞冷凍，并在液氮中長久保存。辦法同普通細(xì)胞株的凍存與復(fù)蘇辦法，凍存液則是在培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加10%～15%DMSO(最佳用時配制)。復(fù)蘇溶解后一定要盡快加培養(yǎng)液稀釋凍存液，減少DMSO對細(xì)胞的毒性作用，離心，棄上清液，重新加培養(yǎng)液培養(yǎng)。(1)ESCs的凍存：①冷凍保護(hù)劑：冷凍保護(hù)劑是指能夠保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，可分為滲入性和非滲入性兩種。不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)缺點，如DMSO即使是一種最優(yōu)先選擇的、最有效的、廣泛使用的冷凍保護(hù)劑，其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前滲入到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，減少細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮，但它本身有一定的毒性，能夠和不溶于水的蛋白殘留物起反映，造成蛋白的變性和破壞。如何充足發(fā)揮DMSO低溫保護(hù)細(xì)胞的效應(yīng)，又能有效減少其細(xì)胞毒性作用，是ESCs低溫保存的重要問題。②保存溫度：即使有研究表明-196℃冷凍的干細(xì)胞，細(xì)胞的增殖和分化能力變化很小，但由于程序降溫，液氮保存設(shè)備昂貴、費時、難以普及，故人們始終謀求一種更簡樸、可靠的辦法來保存ESCs。-80℃直接冷凍保存ESCs逐步顯示其優(yōu)越性，并受到廣泛的重視和推廣。③冷凍辦法(以小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞為例)：對需凍存的細(xì)胞——從胎腦和脊髓中分離到的原代細(xì)胞或經(jīng)體外培養(yǎng)處在對數(shù)生長久的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，收集細(xì)胞至離心管，于4℃15000r/min離心10分鐘后吸棄上清液，按冷凍細(xì)胞所需濃度每毫升(1～2)×106細(xì)胞，定量加入預(yù)冷的神經(jīng)干細(xì)胞凍存液，充足混勻后，將此細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冷凍管中，每管1ml，封口做好標(biāo)記。將冷凍管放入隔熱的泡沫塑料盒內(nèi)，直接放入-80℃低溫冰箱過夜，翌日轉(zhuǎn)入液氮中保存。(2)ESCs的復(fù)蘇：解凍過程也可影響到細(xì)胞的活性。許多研究已證明，復(fù)溫速度越快越好，普通是在37～40℃的水浴中解凍2分鐘左右，快速復(fù)溫可避免重結(jié)晶現(xiàn)象的發(fā)生，使凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后仍保持其正常的構(gòu)造和功效。以小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞為例，將冷凍管快速由液氮轉(zhuǎn)入到37～40℃水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免污染，不定時攪拌加速解凍。當(dāng)細(xì)胞將要完全解凍時，用含70%乙醇的消毒棉擦拭冷凍管消毒，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有4℃預(yù)冷的神經(jīng)干細(xì)胞復(fù)蘇液的試管中(按1∶10的比例)，1500r/min離心10分鐘，去除DMSO，將細(xì)胞重懸于新鮮的干細(xì)胞培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞至適宜濃度，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.ESCs的鑒定：ESCs是一種正常的胚胎性干細(xì)胞，含有正常二倍體核型、體內(nèi)外分化能力及整合到宿主內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并共同發(fā)育成嵌合個體的能力，但其易分化變異，引發(fā)這些能力的削弱甚至消失，故對ESCs長久傳代培養(yǎng)時要及時進(jìn)行ESCs核型的鑒定、體內(nèi)外分化能力及嵌合能力的觀察，以鑒定ESCs與否發(fā)生分化。(1)形態(tài)鑒定：ESCs胞體較小，核大，有1至多個核仁，細(xì)胞致密，細(xì)胞間無界限，ESCs集落形似鳥巢，集落周邊整潔，與喂養(yǎng)層界限分明。(2)核移植：ESCs最重要的特性即全能性。以待測細(xì)胞作為核供體注射到去核的卵母細(xì)胞中，觀察該重構(gòu)胚與否能夠正常發(fā)育并產(chǎn)生后裔，進(jìn)而擬定與否為ESCs。這是一種最可靠的鑒定辦法。(3)核型鑒定：ESCs應(yīng)含有正常的二倍體核型。高分辨率分帶技術(shù)如染色體G帶技術(shù)可精確地識別染色體，判斷核型與否正常。(4)堿性磷酸酶(AKP)活性檢測：ESCs中AKP含有較高的活性，而在已發(fā)生分化的ESCs中AKP的體現(xiàn)驟然減少，甚至是不體現(xiàn)，故能夠通過AKP活性檢測來判斷ESCs與否發(fā)生了分化。用染色液固藍(lán)RR或固綠B鹽、萘酚AS-TR磷酸鹽進(jìn)行鑒定，陽性染色細(xì)胞為紅色，陰性無色。(5)Oct-4活性檢測：Oct-4是維持細(xì)胞多能性的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，是POU家族組員。有資料表明缺少Oct-4的胚胎在附置后很快死亡，由于其ICM不能正常發(fā)育，OCT-4是細(xì)胞含有全能性的標(biāo)志。ES細(xì)胞中含有OCT-4基因，經(jīng)OCT-4基因產(chǎn)物的免疫熒光檢測ESCs可呈陽性著色。(6)體外分化能力觀察：將ESCs按常規(guī)辦法消化，但不要吹打成單細(xì)胞懸液而讓其保持團(tuán)塊狀。移至無喂養(yǎng)層培養(yǎng)瓶(皿)內(nèi)，培養(yǎng)液中不加LIF，胎牛血清濃度降至10%。按常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，每天觀察，輕輕晃動培養(yǎng)瓶(皿)或用吸管吹打，每天2～3次，不讓ESCs團(tuán)塊貼壁和粘連在一起，必要時更換部分培養(yǎng)液。每天觀察，普通3天左右ESCs團(tuán)塊開始分層，外部一層是較大的內(nèi)胚層樣細(xì)胞，內(nèi)部細(xì)胞小而緊密，為外胚層樣細(xì)胞和干細(xì)胞。此時為簡樸類胚，培養(yǎng)至5～10天，分層增多，并逐步出現(xiàn)囊腔，最后細(xì)胞團(tuán)脹大成圓泡狀，為囊狀胚。如果細(xì)胞團(tuán)貼壁并且分化，長出如上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多個細(xì)胞，將這些細(xì)胞團(tuán)挑出固定，可初步理解其分化時間和分化能力的強(qiáng)弱。不同的ESCs分化能力不同，根據(jù)其分化程度的不同，可初步理解其分化能力的強(qiáng)弱。(7)體內(nèi)分化能力的觀察：①取生長良好的ESCs，按常規(guī)辦法消化制成單細(xì)胞懸液。②800～1000r/min離心5～10分鐘，棄上清液。③加入少量培養(yǎng)液，調(diào)成高濃度細(xì)胞懸液(約1×108個/ml)。④取同種小鼠，腹股溝注射ESCs高濃度懸液，每只鼠約1×107個細(xì)胞?；蚪臃N裸小鼠腹股溝皮下，每只鼠1×106個細(xì)胞即可。⑤小鼠接種細(xì)胞后放回籠內(nèi)喂養(yǎng)，約2周腹股溝注射處出現(xiàn)腫塊，4～5周后，腫塊進(jìn)一步增大，處死小鼠，摘除腫塊。⑥腫塊一部分固定，切片，染色，觀察；另一部分消化制成單細(xì)胞懸液(辦法同MEFs的制備)體外培養(yǎng)。繼續(xù)觀察，切片中可見屬于各個胚層的分化組織，如多個上皮組織、神經(jīng)纖維、角質(zhì)化的復(fù)層扁平上皮、肌肉組織、軟骨、硬骨、腺腔、神經(jīng)管以及干細(xì)胞巢等，為畸胎瘤構(gòu)造，恰如將小鼠胚胎異位移植后的成果。體外培養(yǎng)的細(xì)胞見有多個細(xì)胞生長，如上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及干細(xì)胞集落等等。⑦腹腔注射，劑量同腹股溝接種。見小鼠腹部逐步脹大，2～3周后，處死小鼠，打開腹腔，可見大小不一畸胎瘤腫塊游離或粘連在腸系膜上。同樣可摘除固定、切片、染色以及體外培養(yǎng)，觀察辦法同上。(8)嵌合能力觀察：將ESCs注射到宿主囊胚腔內(nèi)，可與宿主內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞發(fā)生整合共同發(fā)育成個體，即嵌合體(chimera)。來源于不同動物品系的ESCs，有不同的遺傳特點，通過這些遺傳特性的觀察，可擬定ESCs與否整合、分化、發(fā)育，現(xiàn)在最慣用的辦法是對新生個體毛色的觀察。①擬定ESCs的來源及選擇宿主鼠品系：大多數(shù)ESCs來源于129品系小鼠。129小鼠毛色為野灰色，應(yīng)選擇白化體鼠(如BALB/c)和非野灰色鼠(如C57BL/6)；也有來源于C57BL/6鼠的ES細(xì)胞，則應(yīng)選白化體鼠(如BALB/c)和野灰色鼠(如129鼠)，產(chǎn)生的嵌合體應(yīng)是花色鼠，被毛是白色和野灰色或黑色相間，眼睛虹膜為野灰色或黑色。②準(zhǔn)備3.5天受體囊胚(同前)。③生長良好的ES細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液。④應(yīng)用顯微注射儀將ESCs注射到受體囊胚腔，每個囊胚5～10個ES細(xì)胞。⑤將注有ESCs的囊胚移植到假孕鼠子宮腔，使之發(fā)育并產(chǎn)下個體，鑒定嵌合狀況(圖16-1)。圖16-1嵌合體的制備過程5.操作注意事項：(1)定時將未分化的細(xì)胞集落從已分化的細(xì)胞中分離出來并接種到新的培養(yǎng)基上。(2)轉(zhuǎn)移細(xì)胞時盡量快，以免細(xì)胞發(fā)生解離和死亡。(3)分離細(xì)胞集落時使每個部分含5～10個細(xì)胞，否則細(xì)胞過多將造成分化，細(xì)胞過少則克隆的效率低。(4)由于ESCs是對多個內(nèi)毒素最為敏感的細(xì)胞，故要重視培養(yǎng)液和血清的質(zhì)量。(5)重視原始喂養(yǎng)層細(xì)胞的質(zhì)量，沒有原始喂養(yǎng)層細(xì)胞所在的胚胎干細(xì)胞將在7～10天內(nèi)分化或死亡，若原始喂養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量差，則不能有效地克制ESCs的分化而造成培養(yǎng)增殖失敗。6.技術(shù)問題討論：(1)培養(yǎng)液：ESCs的培養(yǎng)液比較特殊，需要使用高糖的DMEM，葡萄糖的濃度要在24.8mmol/L(4500mg/L)以上，要加上巰基β-乙醇(0.1mM)或單硫甘油(0.15mM)，有時還要補(bǔ)充丙酮酸鈉(1mM)和谷氨酰胺(2mM)以及非必需氨基酸(0.1mM)和克制分化的LIF。血清濃度也較高，用10%胎牛血清和10%新生牛血清或用15%胎牛血清。碳酸氫鈉的用量2.2g/L比3.7g/L可能效果更加好。配制培養(yǎng)液必需使用無細(xì)菌內(nèi)毒素污染的超純水或五蒸水。細(xì)菌內(nèi)毒素是一種脂多糖，是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，很低濃度也會影響ES細(xì)胞的增殖。離子交換柱使用時間久，細(xì)菌會生長在樹膠的表面并釋放內(nèi)毒素到過柱的超純水中，故用玻璃蒸餾水器制備的五蒸水可能比用離子交換柱制備的超純水要好。超純水和五蒸水要現(xiàn)用現(xiàn)制備?，F(xiàn)在GIBLO公司生產(chǎn)一種無血清ESCs培養(yǎng)液，可替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)液。血清成分復(fù)雜，不利于整合到ESCs基因組中的外源性基因功效的測定，因此無血清培養(yǎng)基更加好。(2)血清：使用胎牛血清作為ESCs培養(yǎng)液的構(gòu)成部分。選擇一批最適于ESCs生長的胎牛血清很重要，一旦擬定最佳批次，最佳儲藏同批足量血清備用