第13章 免疫組織化學(xué)技術(shù)(二)

ABC間接法原理示意圖待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶

缺點(diǎn)：有些組織如肝、腎、白細(xì)胞、脂肪組織和乳腺等有內(nèi)源性生物素活性，需要對組織進(jìn)行預(yù)處理

ABC復(fù)合物在中性時(shí)帶正電荷，容易與細(xì)胞核等帶負(fù)電荷結(jié)構(gòu)非特異結(jié)合親合素為糖蛋白，可以與凝集素等碳水化合物結(jié)合

優(yōu)點(diǎn)：

敏感性高特異性高一抗和二抗工作濃度低操作時(shí)間縮短可以多重標(biāo)記橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)

BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB原理：是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價(jià)性，將檢測反應(yīng)體系中抗原、生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素聯(lián)結(jié)起來，達(dá)到檢測反應(yīng)分子的目的。由于生物素化抗體分子上連有多個(gè)生物素，因此，最終形成的抗原-生物素化抗體-親合素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物可積聚大量的酶分子；加入相應(yīng)酶作用底物后，即會產(chǎn)生強(qiáng)烈的酶促反應(yīng)，從而提高檢測的靈敏度。BRAB直接法原理示意圖待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶BRAB間接法原理示意圖待測抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶標(biāo)記生物素-抗生物素技術(shù)

LabelledAvidin-biotintechnique，LAB原理:以標(biāo)記親合素直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測。特點(diǎn):

相當(dāng)高的靈敏度，省略了加標(biāo)記生物素步驟，操作較BRAB法簡便。間接LAB法采用生物素化第二抗體，可進(jìn)一步提高檢測靈敏度二、葡萄球菌A蛋白法定義:葡萄球菌蛋白A/SPA是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它能與多種動物IgG的Fc段結(jié)合，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測實(shí)驗(yàn)SPA可以和人及多種動物的IgG結(jié)合，解決不同動物檢測時(shí)，需分別標(biāo)記相應(yīng)二抗的問題SPA結(jié)合部位是Fc段，因此不會影響抗體的活性

SPA具有雙價(jià)結(jié)合力SPA對IgG

亞型的結(jié)合有選擇性，可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果三、凝集素法凝集素/lectin

是指一類從植物種子、無脊椎動物和較高等動物組織中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)，可使紅細(xì)胞凝集故稱凝集素凝集素具有與特定糖基專一結(jié)合的特性，是研究腫瘤細(xì)胞膜糖分子變化的一種理想工具凝集素法就是一方面利用凝集素可以與標(biāo)記物結(jié)合，另一方面又可以與細(xì)胞膜糖基結(jié)合所形成一種親合反應(yīng)直接法是將標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，與組織細(xì)胞相應(yīng)的糖蛋白或糖脂相結(jié)合。間接法是先將凝集素與組織細(xì)胞膜糖基結(jié)合，然后再用標(biāo)記的抗凝集素抗體與結(jié)合在細(xì)胞上的凝集素反應(yīng)-凝集素-糖法，這種方法是利用生物細(xì)胞膜的特殊糖基與凝集素結(jié)合后，再用標(biāo)記的已知糖基與其反應(yīng)，形成一個(gè)“三明治樣”的結(jié)合物。四、鏈霉親合素-生物素法(LSAB）

鏈霉親合素(StreptavidinSA)是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，不含糖基，有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，并且具有高度的親和力，其功能類似親合素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親合素蛋白就組合成酶標(biāo)鏈霉親合素-生物素方法第五節(jié)免疫電鏡技術(shù)一、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)的原理

免疫電子顯微鏡（ImmunoelectronMicroscope，IEM）技術(shù)是利用高電子密度的顆粒性標(biāo)記物（如膠體金、鐵蛋白等）標(biāo)記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物，在電子顯微鏡下對高電子密度標(biāo)記的抗原（抗體）進(jìn)行亞細(xì)胞水平定位的技術(shù)。特點(diǎn):

定位更為精確，可定位至細(xì)胞膜、細(xì)胞器在探索病因、發(fā)病機(jī)制、組織發(fā)生等方面有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)二、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本的制備要求

標(biāo)本制備的要求是保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，注意保持組織的抗原性，因此在組織固定與取材時(shí)選用固定劑不宜過強(qiáng)。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。三、常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)免疫膠體金染色法

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)膠體金是由氯金酸在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。它在弱堿環(huán)境下可與蛋白質(zhì)分子形成牢固的靜電結(jié)合而不影響蛋白質(zhì)的生物特性。分類：按染色步驟

直接法間接法按標(biāo)記與包埋的關(guān)系

包埋前標(biāo)記法：抗原活性保存較好，標(biāo)記率較高包埋后標(biāo)記法：可對一個(gè)材料反復(fù)進(jìn)行標(biāo)記，試劑用量少前列腺內(nèi)分泌-旁分泌細(xì)胞免疫膠體金染色顯示有降鈣素的沉積應(yīng)用：細(xì)胞表面成份的研究膠體金技術(shù)與冷凍蝕刻技術(shù)結(jié)合-細(xì)胞膜蛋白顆粒或其它膜成份進(jìn)行精細(xì)定位電鏡原位雜交技術(shù)，能夠在超微水平上精確定出基因位點(diǎn)免疫膠體鐵細(xì)胞化學(xué)染色法

膠體鐵是一種陽離子膠體，將抗體分子標(biāo)記上膠體鐵，通過普魯藍(lán)反應(yīng)呈色，膠體鐵顆粒有一定大小，還具有一定電子密度，可用在電鏡和光鏡水平的抗原定位研究。酶免疫電鏡技術(shù)酶免疫電鏡技術(shù)是利用酶的高效率的催化作用對其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度，借助于電子顯微鏡觀察，證明酶的存在，從而對抗原進(jìn)行定位。第六節(jié)免疫組化技術(shù)的應(yīng)用一、免疫組織化學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用自身抗體的檢測游離在外周血中的抗體固定在組織中的的抗體HEP-2細(xì)胞抗著絲?？贵w的陽性顯色腎小球抗基底膜抗體的陽性顯色細(xì)菌、病毒的快速鑒定藤黃微球菌綠色-活菌紅色-死菌寄生蟲的檢測與研究猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲繁殖吖啶橙染色綠色-DNA紅色-RNA惡變組織中腫瘤抗原的檢測人肝癌細(xì)胞吖啶橙染色其他：免疫熒光技術(shù)也應(yīng)用于血液中B細(xì)胞和T細(xì)胞及其亞群的鑒定、特殊染色體的鑒定、激素和酶的局部組織定位等方面。酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用提高病理診斷準(zhǔn)確性（HE可觀察到炎性細(xì)胞浸潤，ED1染色可觀察到巨噬細(xì)胞浸潤）Survivin在肝癌細(xì)胞核的表達(dá)癌基因蛋白的臨床應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞增生程度的評價(jià)Ki67在小肝癌組織中的表達(dá)腫瘤轉(zhuǎn)移分期判斷腫瘤的靶向治療輔助診斷免疫性疾病和感染性疾病，觀察免疫復(fù)合物沉積狀況

二、免疫組織化學(xué)技術(shù)的拓展熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）FACS是將免疫熒光與細(xì)胞生物學(xué)、流體力學(xué)、激光和微機(jī)信息處理系統(tǒng)等多學(xué)科的高新技術(shù)融為一體，進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究的一種先進(jìn)儀器FACS原理示意圖488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector共聚焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用“細(xì)胞CT”！激光掃描共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscope，簡稱LSCM)工作原理共軛光路使非焦平面的光線被抑制，減少了干擾，以及使用光色較純的激光，所以成像分辨率更高增加了激光掃描部分，可連續(xù)、固定范圍內(nèi)小功