第四章 酶蛋白的化學(xué)修飾

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酶工程第三章酶蛋白的化學(xué)修飾第一節(jié)化學(xué)修飾的原理第二節(jié)化學(xué)修飾的方法學(xué)第三節(jié)酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的修飾第四節(jié)酶的親和修飾第五節(jié)酶的化學(xué)交聯(lián)第六節(jié)酶化學(xué)修飾的應(yīng)用第一節(jié)化學(xué)修飾的原理

一、酶的化學(xué)修飾原因1．穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4．臨床應(yīng)用的特殊要求。二、定義

酶分子的化學(xué)修飾就是在分子水平上對(duì)酶進(jìn)行改造，以達(dá)到改構(gòu)和改性的目的。即在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)(物質(zhì))，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種物質(zhì)被稱為修飾試劑?；瘜W(xué)修飾酶主要用于基礎(chǔ)酶學(xué)的研究和疾病治療。三、酶化學(xué)修飾的基本原理1．如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2．如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑3．如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境影響酶化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素主要有兩個(gè)：酶蛋白功能基的反應(yīng)性修飾劑的反應(yīng)性影響酶化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素：酶蛋白功能基的反應(yīng)性微區(qū)的極性：是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。氫鍵效應(yīng)：蛋白質(zhì)或其離子通過(guò)氫鍵來(lái)維持穩(wěn)定性。靜電效應(yīng)：帶電基團(tuán)之間的相互影響造成的。位阻效應(yīng)：當(dāng)烷基在空間上緊靠著蛋白的功能基，會(huì)使修飾劑不能與功能基接觸，這時(shí)會(huì)出現(xiàn)位阻效應(yīng)。酶蛋白功能基的超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。但不一定是酶的活性部位基團(tuán)。影響酶化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素：修飾劑的反應(yīng)性選擇吸附：修飾劑根據(jù)各自特點(diǎn)，選擇性地吸附在低極性區(qū)域或高極性區(qū)，形成蛋白質(zhì)－修飾劑復(fù)合物。靜電相互作用：帶電修飾劑可以選擇性地吸引在蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度)位阻因素：位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。(α－溴代酸的大小影響修飾）催化因素：不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異，較大程度上與酶的酸堿催化有關(guān)。局部環(huán)境的極性：大多反應(yīng)會(huì)與溶劑的極性有關(guān)，且溶劑效應(yīng)相當(dāng)復(fù)雜。第二節(jié)化學(xué)修飾的方法學(xué)

一、修飾劑的要求二、反應(yīng)條件的選擇三、酶性質(zhì)的了解四、酶修飾方法一、修飾劑的要求1．修飾劑的分子大小、修飾劑鏈的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性。2．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置。3．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。在酶蛋白不變性的條件下有選擇性地與氨基酸殘基反應(yīng)，易分離修飾后的衍生物以便進(jìn)行測(cè)定?！鶕?jù)修飾目的、專一性而定二、反應(yīng)條件的選擇

反應(yīng)條件應(yīng)盡可能保證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變或少變的情況下進(jìn)行。

——避免不可逆變性、有利于專一性修飾蛋白

1．反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例。酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。2．反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pH條件。pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。3．反應(yīng)溫度及時(shí)間。嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。三、酶性質(zhì)的了解1．酶活性部位情況?；钚灾行幕鶊F(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。2．酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件。熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。3．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)熱穩(wěn)定性抗原性體內(nèi)半衰期酶學(xué)性質(zhì)的改變最適pH對(duì)組織的分布能力變化熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性增加修飾劑與酶多點(diǎn)交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增強(qiáng)了酶的熱穩(wěn)定性。增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活。抗原性部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明顯。

修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)體內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)

修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)酶學(xué)性質(zhì)的改變絕大多數(shù)酶經(jīng)過(guò)修飾后，最大反應(yīng)速度沒有改變，但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)會(huì)增大。修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)對(duì)組織的分布能力變化對(duì)組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收。最適pH有些酶經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生變化。修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)四、酶修飾方法

酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾有機(jī)大分子對(duì)酶的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)類及其他對(duì)酶的化學(xué)修飾第三節(jié)酶蛋白側(cè)鏈的修飾

一、幾種重要的修飾反應(yīng)

?；磻?yīng)烷基化反應(yīng)氧化和還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾三、研究新熱點(diǎn)一、幾種重要的修飾反應(yīng)1．酰化及其相關(guān)反應(yīng)2．烷基化反應(yīng)

3．氧化和還原反應(yīng)

4．芳香環(huán)取代反應(yīng)

二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾

1．巰基的化學(xué)修飾巰基具有很強(qiáng)的親核性，采用巰基化學(xué)修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。常用修飾劑：烷基化劑、酰化基、馬來(lái)酰亞胺2．氨基的化學(xué)修飾氨基容易被選擇性修飾，氨基烷基化已成為重要的賴氨酸修飾方法，化學(xué)修飾也常用于蛋白質(zhì)序列分析（多肽鏈的N端分析）。常用修飾劑：鹵代乙酸、芳香鹵、磷酸吡哆醛、2，4－二硝基氟苯DNFB、丹磺酰氯DNS3．羧基的化學(xué)修飾

4．咪唑基的化學(xué)修飾組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，修飾劑焦碳酸二乙酯DPC對(duì)其有較好的專一性，修飾產(chǎn)物在240nm處有最大吸收。常用修飾劑：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯DPC（均能修飾咪唑環(huán)上的兩個(gè)氮原子）5．胍基的化學(xué)修飾精氨酸殘基的胍基在中性或弱堿性條件下能與修飾劑發(fā)生反應(yīng)。常用修飾劑：具有兩個(gè)臨位羰基的化合物——丁二酮、苯乙二醛、1，2－環(huán)己二酮等。6.酚羥基的化學(xué)修飾

酪氨酸殘基的酚羥基可被修飾。蘇氨酸和絲氨酸殘基的羥基也可被該類修飾劑修飾，且產(chǎn)物更為穩(wěn)定，但反應(yīng)條件嚴(yán)格。四硝基甲烷TNM在溫和條件下高度專一性地硝化，生成可電離的發(fā)色物質(zhì)，可用于氨基酸定量分析。常用修飾劑：四硝基甲烷TNM、碘、二異丙基氟磷酸酯DFP7.色氨酸吲哚基的化學(xué)修飾色氨酸殘基的吲哚基比巰基、氨基反應(yīng)性差，HNBB和4－硝基苯硫氯對(duì)吲哚基修飾比較專一。Koshland試劑Ⅱ[二甲基－（2－羥基－5－硝基芐基）溴化锍],水溶性好，有利于修飾酶，修飾色氨酸時(shí)應(yīng)對(duì)巰基進(jìn)行