熒光原位雜交

熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子(reportermolecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料.熒光原位雜交FISH的原理FISH的操作及應(yīng)用FISH的展望FISH的原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。。熒光原位雜交原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤差等。與之比FISH的優(yōu)點(diǎn)①操作操作簡(jiǎn)便,探針標(biāo)記后穩(wěn)定,一次標(biāo)記后可使用二年②方法敏感,能迅速得到結(jié)果③在同一標(biāo)本上,可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針.④不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究,而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究.

缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。熒光原位雜交FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟：1）探針的制備和標(biāo)記2）探針及標(biāo)本變性3）雜交4）洗脫5）雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）6）封片7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果熒光原位雜交探針的制備和標(biāo)記

探針是一段帶有熒光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其長(zhǎng)度介于15至數(shù)千個(gè)核苷酸之間，但以250~650個(gè)核苷酸雜交效果最好探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。直接標(biāo)記是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。熒光原位雜交單拷貝探針：（1）種類：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段

（2）應(yīng)用

（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證；

（b）確定染色體微小缺失與重復(fù)；

（c）染色體斷裂點(diǎn)分析。

（d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。熒光原位雜交單拷貝探針DNA片段的染色體定位熒光原位雜交單拷貝探針FISH檢測(cè)微小缺失熒光原位雜交單拷貝探針FISH檢測(cè)微小缺失熒光原位雜交染色體片段重復(fù)Dup19(p13.2-13.1)熒光原位雜交簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simplerepetitiveprobes)

——異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromaticcentromerprobes)

其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。

特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)

應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別

(b)染色體數(shù)目異常檢測(cè)

(c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷

熒光原位雜交簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針熒光原位雜交染色體的著絲粒異染色質(zhì)區(qū)域簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：

細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時(shí)期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。熒光原位雜交染色體涂染探針染色體涂染探針(chromosomepaintingprobes)

整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針

探針來源：

（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；

（2）熒光激活的流式細(xì)胞儀(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；

（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增；

應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析；

（2）不同物種間的同源性比較；

（3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。熒光原位雜交染色體涂染探針

人類染色體結(jié)構(gòu)分析熒光原位雜交染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分析熒光原位雜交多色復(fù)合染色體FISH探針多色FISH（muti-colorFISH)

多色復(fù)合染色體FISH探針(multiplexFISH,M-FISHprobes)

兩種以上不同的非同位素標(biāo)記，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。熒光原位雜交多色復(fù)合染色體FISH探針熒光原位雜交探針及標(biāo)本的變性1）探針變性將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。2）標(biāo)本變性①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本