.7.23濤哥答疑錄(私聊版)

MJ:問題描述：首先是鋪墊+個人理解樣品墊中離子強(qiáng)度的問題，tirs和氫氧化鈉造成堿性原因是不同的，tirs吸收水中的氫離子，使水電離產(chǎn)生氫氧根離子，而氫氧化鈉直接電離出氫氧根離子，使溶液呈現(xiàn)堿性，所以個人認(rèn)為如果單單是tris體系的緩沖液的話，溶液雖然呈堿性，但是離子強(qiáng)度較低，至少比相同摩爾濃度和酸堿度下，PB緩沖液的離子強(qiáng)度低很多。而您也說過，樣品墊要保持適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度，來應(yīng)對離子強(qiáng)度比較高的樣本。個人覺得離子強(qiáng)度過高的話，會影響抗原抗體的結(jié)合，這個可能沒有什么理論依據(jù)，只是個人覺得。問題1：如果要提高樣品墊中離子強(qiáng)度（我目前比較偏好TB體系，因為離子強(qiáng)度小，個人有離子強(qiáng)度影響結(jié)合的直覺），是加入PB體系，并且提高濃度，還是說不加PB，轉(zhuǎn)而加氯化鈉？問題2：目前在做全血樣品墊，大概的思路是：緩沖對+表面活性劑+抗RBC，篩選抗RBC的種類，切換濃度，看最適合的抗RBC的種類和量，這樣的做法的話就要求緩沖對+表面活性劑這個母液種類最好相對定，不然組別太多了，目前打算用100mMTris+40mMPB+1%Brij-35嘗試，想問下這樣的思路有沒有問題，或者有沒有能改進(jìn)的地方，要不您直接推薦個緩沖對+表面活性劑的配方？大概就是這樣，應(yīng)該夠具體了吧，請解答下吧T:你的直覺很對首先，樣品墊中離子強(qiáng)度的問題，tirs和氫氧化鈉造成堿性原因是不同的，tirs吸收水中的氫離子，使水電離產(chǎn)生氫氧根離子，而氫氧化鈉直接電離出氫氧根離子，使溶液呈現(xiàn)堿性，所以個人認(rèn)為如果單單是tris體系的緩沖液的話，溶液雖然呈堿性，但是離子強(qiáng)度較低，至少比相同摩爾濃度和酸堿度下，PB緩沖液的離子強(qiáng)度低很多。你這段說的很對。TRIS相對于BBSPBSCBS這些確實(shí)離子強(qiáng)度低一些個人覺得離子強(qiáng)度過高的話，會影響抗原抗體的結(jié)合，這個可能沒有什么理論依據(jù)，只是個人覺得。這個說的也對。首先呢，我們先對樣品墊處理液的緩沖系統(tǒng)定下一個原則，要明白，樣品墊處理液中，我們?yōu)槭裁匆尤刖彌_系統(tǒng)。加入緩沖系統(tǒng)的目的主要是糾正個體樣本間PH的差異，也就是看重其緩沖能力。那么，緩沖系統(tǒng)在什么條件下緩沖能力比較強(qiáng)呢？任何一種緩沖系統(tǒng)都有一個最佳的緩沖范圍，比如TRIS-HCL體系最佳的緩沖范圍是8.0附近，大概是7.5-8.5之間。你在調(diào)整PH的時候，應(yīng)該會有感覺：一開始加鹽酸的時候PH降的很快，到8.5左右的時候PH就降的很慢了，低于7.5的時候又下降很快了，在8.0左右的時候是最慢的需要加很多鹽酸，PH才會發(fā)生明顯變化。而PB呢，其最佳緩沖范圍在中性略偏堿性附近，也就是7.2左右。而硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液呢、最佳緩沖范圍大概在9.0左右。所以，我們該如何選擇緩沖系統(tǒng)呢？原則就有了：首先，我們會選擇一個緩沖范圍相對廣泛的緩沖體系，然后調(diào)整各種PH，觀察每個PH條件下的性能。比如，我們發(fā)現(xiàn)樣品墊PH在9.0左右效果最好，那么，我們可以直接選擇硼酸鹽緩沖液。如果我們發(fā)現(xiàn)，樣品墊PH在8.2左右效果最好，那就選擇TRIS。如果發(fā)現(xiàn)樣品墊處理液PH在7.0左右效果最好，那就選擇PB。不過，這里面有個問題，如果你一開始用0.01M的TRIS，會發(fā)現(xiàn)各個PH條件下性能變化不明顯。因為，這個濃度下TRIS的緩沖能力比較弱，也就是說一個緩沖體系的緩沖能力，不光跟PH有關(guān)，跟其使用濃度也有關(guān)。所以，最開始探索的時候，建議用0.1M的tris這樣結(jié)果差異會更明顯。你剛才說到一點(diǎn)，離子強(qiáng)度會影響抗原抗體的反應(yīng)，這點(diǎn)很重要，抗原抗體的免疫反應(yīng)主要就是那幾個作用力，而電荷對這些作用力的干擾是很明顯的，這種干擾不光體現(xiàn)在電荷的正負(fù)而且體現(xiàn)在數(shù)量上，所以合適的離子強(qiáng)度是很重要的，抗原抗體的反應(yīng)有一個最佳的離子強(qiáng)度范圍，這個需要探索，當(dāng)我們選擇一種緩沖系統(tǒng)之后一般PH會首先確定下來，接下來要對緩沖系統(tǒng)的濃度進(jìn)行篩選。比如我們選擇了0.05M的Tris，此時，性能能夠達(dá)到最佳狀態(tài)，然后我們在這個緩沖系統(tǒng)基礎(chǔ)上，添加其它物質(zhì)，用于進(jìn)一步改善產(chǎn)品的性能。如果在性能評估和工藝調(diào)試過程中發(fā)現(xiàn)體系的抗干擾能力偏弱，比如你做早孕的項目，不同個體尿液的離子強(qiáng)度差異很大，有的會造成假陽性，這個時候你就需要考慮增強(qiáng)體系的抗干擾能力，如何屏蔽個體樣本離子強(qiáng)度的差異，這個我之前應(yīng)該給你講過，通過高鹽的加入，可以達(dá)到這個目的，這個時候再加入氯化鈉。也就是說氯化鈉不是工藝體系所必需的組分，是根據(jù)需要而加入的，起輔助功能。有時候單純靠提高緩沖系統(tǒng)的濃度并不能完全解決問題，一味提高可能會出現(xiàn)副作用，這個時候就該考慮換個思路，加氯化鈉配伍一下，幾種物質(zhì)的配伍往往能夠解決矛盾的問題，你想想看，整個體系是一個整體，牽一發(fā)而動全身，如果我們加入氯化鈉之后體系的抗干擾能力增強(qiáng)了，但是靈敏度變?nèi)趿?，咋辦呢？需要通過其它的方式再去增強(qiáng)，也就是說我們一邊降低靈敏度，一邊又升高靈敏度，表面看來是做了無用功，實(shí)際上，我們提高了整個體系的抗干擾能力，基于不同的方法，對產(chǎn)品靈敏度的條件，都是為了解決特定的矛盾的問題。第二個問題首先你的思路是對的就是，先用最基本的工藝，來確定RBC的用量，不過，你這個母液不太合適。你為毛打算用兩種緩沖系統(tǒng)呢？你加兩種緩沖系統(tǒng)有點(diǎn)不倫不類，另外可能會互相影響緩沖范圍和緩沖能力。另外Brij35并不是最常用的一種表面活性劑，其主要是為了增加特異性，建議用常規(guī)的非溶血性表面活性劑，當(dāng)然你用Brij35也沒錯，只是我個人不習(xí)慣而已。MJ：手頭有t20、t80、曲拉通100、s9、birj35哪個好？T：S9吧，S17也行，S17我那有。另外，檢測血液的，表面活性劑沒必要這么高濃度，一般0.5%-0.75%比較好。MJ：為毛不需要那么高？T：你用非溶血性的表面活性劑，往往都是固態(tài)的，比如S9，量多了容易粘稠，反而不利于層析。第三個問題，我可以先跟你說說，其實(shí)，鼠抗、兔抗、本身都不是問題，不存在哪個更好，而在于哪個更合適。紅細(xì)胞表面有很多抗原表位，其中一些表位是重復(fù)的，也就是多價的。這些重復(fù)的表位在參與免疫反應(yīng)的時候很容易導(dǎo)致凝集反應(yīng)，因此如果你用了一個單抗，這個單抗呢針對的紅細(xì)胞抗原表位是最豐富的，而且這個單抗的親和力很強(qiáng)，那么客觀上來說這個單抗導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集的效率就會很高，此時，多抗就顯得有點(diǎn)遜色了。因為多抗是有眾多單抗組成的，其中一部分單抗，其實(shí)根本發(fā)揮不了作用，因為，他們針對的抗原表位太單一，不能形成明顯的凝集反應(yīng)。MJ：萬一多抗里80%的抗體都只能結(jié)合一個紅細(xì)胞，剩下的20%去形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的話，那豈不是很糾結(jié)？T：當(dāng)然，一般不會這樣的哈，因為，免疫過程是有選擇性的，也就是說，機(jī)體往往對免疫原上面免疫能力強(qiáng)的表位產(chǎn)生很強(qiáng)的應(yīng)答。也就是說，一般來講，多抗里面大部分還是針對紅細(xì)胞的多價表位的。如果這個單抗親和力偏弱呢，就不好說怎么樣了，如果這個單抗針對的抗原表位太單一呢，就沒啥用了。當(dāng)然，這樣的單抗供應(yīng)商是不會出售的，但是單抗的親和力畢竟存在差異，所以不同廠家提供的單抗性能就存在差異，有的廠家的單抗比多抗效果好有的則相反，因此單純說單抗好，還是多抗好沒有意義。多抗的好處就是：雖然我考不了100分，但是我一般不會低于80分。另外還有一點(diǎn)，也是選擇的原則之一，就是對質(zhì)控線的影響，如果你某個產(chǎn)品采用了間接質(zhì)控，比如說你HIV的項目你不想做直接質(zhì)控，而做一個間接質(zhì)控比如你標(biāo)記一個兔IgG，然后C線用羊抗兔，那么如果你RB選擇了兔多抗，就有問題了。游離兔抗體太多了，會導(dǎo)致C線不顯色。再比如，你肌鈣蛋白I的項目標(biāo)記的是鼠單抗，C線用的羊抗鼠，那么如果RBC是鼠單抗，對C線的顯色也會產(chǎn)生影響。還有一點(diǎn)，關(guān)于阻斷劑，阻斷劑從本質(zhì)上來講也是一種鼠源抗體，阻斷劑的用量還不至于對質(zhì)控線形成致命的影響。如果你的RBC是鼠源抗體，阻斷劑也是鼠源抗體，客觀上如果是HAMA陽性樣本，你的鼠抗紅細(xì)胞抗體會跟HAMA反應(yīng)的，如果說好事呢，也算好事，起碼RBC抗體協(xié)助了阻斷劑來消滅HAMA，這個屬于援助，但是，消滅HAMA，不是RBC抗體的任務(wù)，他這屬于幫別人完成了任務(wù)，他自己的任務(wù)呢？兵力分散了，效果肯定要受到影響啊。比如，你這個HAMA陽性樣本是一個全血樣本，30%的RBC抗體去結(jié)合HAMA了，剩下70%的去凝集紅細(xì)胞，效果就大打折扣了。我說這個的意思并不是是用鼠源RBC抗體就一定會產(chǎn)生消極的影響，而是說你在進(jìn)行RBC的篩選和用量控制的時候一定要考慮到這些問題，另外就算你用的兔源RBC抗體也面臨同樣的問題，因為類風(fēng)濕因子跟很多種屬的抗體都會發(fā)生反應(yīng)，簡單點(diǎn)說，比如你RBC用量探索的時候1ug/人份，效果就夠了1.5ug也行，就盡量用1.5ug。什么源的都會遇到一些問題，所以如何去屏蔽這些問題合理選擇RBC抗體種類及用量是一門學(xué)問啊。MJ：還有幾個小問題明天我就100mMtris+0.5%的S9pH=8.5作為母液上？篩選抗rbc種類和濃度T：就這個，先用最簡單的，這個沒問題之后再有針對性調(diào)整。有這樣的說法MJ：有這樣的說法，ph8.7最適合抗原抗體反應(yīng)？還有brij35增加特異性是怎么回事兒？T:額，抗原抗體的反應(yīng)，在體內(nèi)，PH7.2左右是最合適的PH，但是在體外就不一定了，特別是當(dāng)體系中含有其它各種組分的時候，這個最佳的PH就千差萬別了，所以一般來講每個項目每個原料都是要探索的。當(dāng)然，很多時候，我們不會做的這么仔細(xì)一般做的東西做了，也就大概有個印象了。所以PH8.7這個說法就是欠揍。BRIJ35增加特異性的機(jī)理在于改變蛋白的三維構(gòu)象進(jìn)而使其容易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活躍位點(diǎn)隱藏起來，至于其如何達(dá)到這種效果的，不好解釋。影響蛋白三維構(gòu)象的物質(zhì)，歸根到底，就是那些可以影響氨基酸之間作用力的物質(zhì)，比如疏水作用力對表面活性劑敏感，比如靜電作用力對PH和離子強(qiáng)度敏感。MJ：最后一個問題是：抗體、或者說蛋白，在我的印象里應(yīng)該是液體保存在緩沖液里面的，固體在NC膜或者在金殿上我就認(rèn)了，抗體直接放在樣品墊上，會不會很容易歇菜?T：抗體直接放在樣品墊上會吸附樣品墊的，就如同抗體容易吸附NC膜差不多，所以關(guān)于流動封閉其實(shí)有一種作用很多人都不知道。MJ:不是為了防止搞基么？還有什么作用？T：我們封閉樣品墊，比如我們在樣品墊上加酪蛋白或者BSA，其實(shí)有個很重要的作用是封閉樣品墊上的活性位點(diǎn)，比如玻纖上的活性位點(diǎn)。如果我們不封閉樣品墊，檢測肌鈣蛋白I，肌鈣蛋白是一種很容易吸附在玻纖上面的蛋白質(zhì)，這樣檢測結(jié)果會偏低，所以，有