母親亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變和神經(jīng)管缺陷的關(guān)系

母親亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變和神經(jīng)管缺陷的關(guān)系

自1968年e.d.i.habgar和r.w.smhell首次發(fā)現(xiàn)落葉林缺乏與神經(jīng)管缺陷（ntd）有關(guān)以來，女性對(duì)懷孕期間添加落葉林是一個(gè)非常有效的預(yù)防ntd出生的非常有效措施之一，但其功能機(jī)制尚不清楚。亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)是1994年由Goyeffe等人首次克隆成功并定位于1p36.3。之后又發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的677C→T突變會(huì)造成此酶活性下降及耐熱性降低,從而引起高半胱氨酸血癥,高半胱氨酸堆積又導(dǎo)致葉酸代謝的紊亂而與神經(jīng)管缺陷(NTD)的發(fā)生有一定的關(guān)系,鑒于國(guó)內(nèi)對(duì)上述研究尚無報(bào)道,且我國(guó)NTD的發(fā)病率又很高,本文首次采用PCR?RFLP法對(duì)24個(gè)生過正常孩子的母親和27位生過NTD患兒的母親的MTHFRC677T突變情況進(jìn)行了研究,以探討母親的該突變?cè)贜TD發(fā)生中的作用及婦女妊娠期定量補(bǔ)足葉酸已成為預(yù)防NTD出生的作用機(jī)制。數(shù)據(jù)和方法一、正常罪犯的dna標(biāo)本哈爾濱市及大慶市各市級(jí)醫(yī)院收集到的曾生過NTD患兒的母親的DNA標(biāo)本,共27份,正常對(duì)照組為曾生過正常孩子母親,共24份。配對(duì)要求孕婦年齡相差±5歲,孕周相差±2周,同民族,同居住環(huán)境,受教育程度相似。二、方法1.提取dns取靜脈血3mlACD抗凝,利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA,DNA濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。2.ccctgptgptgptgrtgatgrtgrtgrtgrt-pcr反應(yīng)PCR擴(kuò)增用DNA熱循環(huán)儀(Perkm?Elmer480),引物序列為:NCO351:5′?GGAGCAGGGAGCTTTGAGGC3′,NCO352:5′?CCCATGTCGGTGCATGCCTT3′反應(yīng)體系為30μl,包括10×Buffer3.0μl,2.5mmol14×dNTP1.5μl,NCOL2μl,NCO22μl,TaqDNA聚合酶0.4μl(5U/μl),H2O19.1μl,基因組DNA2μl。反應(yīng)條件首先是94℃預(yù)變性5分鐘,其后的30個(gè)循環(huán)為94℃30sec,62℃20sec,72℃60sec,循環(huán)結(jié)束再72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增后取10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.2μlTaqI(10u/μl)消化過夜。3.上樣及溶液制備制備12%(交聯(lián)度29:1)非變性聚丙烯酰胺凝膠,100V預(yù)電泳30分鐘,取5μl酶解產(chǎn)物與1μl6×上樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán),40%蔗糖)混勻后上樣,150V恒壓電泳34小時(shí)后揭膠。凝膠經(jīng)過固定(10%乙醇+0.5%乙酸,12分鐘)、染色(0.2%AgNO320分鐘)、顯色(1.5%NaOH+0.4%甲醛至清晰)三步處理后即可進(jìn)行分析。三、顯著性的分析按HALDANE調(diào)整法計(jì)算相對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)RR,分析NTD與可能的風(fēng)險(xiǎn)因子(基因型VV或基因V)的相關(guān)性,并進(jìn)行相應(yīng)的顯著性x2統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(DF=1)。同時(shí)用列聯(lián)表方法分析標(biāo)記基因V或基因型VV與疾病的關(guān)聯(lián)性,對(duì)關(guān)聯(lián)的顯著性采用YATES校正計(jì)算或雙側(cè)FISHER確切概率法計(jì)算(樣本數(shù)小于4O時(shí))。以曾生過NTD患兒的母親作為風(fēng)險(xiǎn)人群對(duì)未曾生過NTD患兒的母親MTHFRC677T的突變頻率進(jìn)行比較分析。采用PPAP軟件進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果一、種基因型的出現(xiàn)由于MFHFR677位點(diǎn)C被T置換后,可產(chǎn)生一個(gè)TaqI限制內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),所以PCR產(chǎn)物酶解電泳后,可分出三種基因型:純合A677/A677由于序列中無TaqI切點(diǎn),所以電泳后只出現(xiàn)一條帶為134bp;純合子V677/V677可見二條帶,分別為75bp,59bp;雜合子A677/V677可見三條帶,分別為134bp,75bp和59bp(見圖1)。二、ntds組的v/v基因型及相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性以曾生過NTD患兒的母親作為風(fēng)險(xiǎn)人群對(duì)生過正常兒童的母親的MTHFRC677T的突變頻率進(jìn)行分析的結(jié)果(表1)為:正常對(duì)照組中V/V基因型的頻率為12.5%,而NTDs組中V/V基因型的頻率占33.3%。對(duì)V/V基因型分析,計(jì)算得到V/V基因型的母親比非V/V基因型的母親生出NTD患兒的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)提高近3倍(RR=3.15),該結(jié)果具有提示性顯著意義(x2=2.95,P<0.1)。進(jìn)一步對(duì)V分析,計(jì)算得到攜帶V基因的母親比不攜帶V基因的母親生出NTD患兒的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)提高近5倍(RR=4.98),結(jié)果有提示性顯著意義(x2=3.42,P<0.1);用列聯(lián)表方法作關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果也具有提示性顯著意義(x2=2.12,P<0.1)。改變hcy的基因結(jié)構(gòu)脊柱裂、腦積水和無腦兒是一系列由于神經(jīng)管未閉合引起的新生兒出生缺陷(NTD)。有關(guān)NTD的致病因素目前仍不清楚,國(guó)內(nèi)外多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NTD是遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。最近,國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn),在懷有NTD患兒的婦女血中有輕度高半胱氨酸(Hcy)水平上升的現(xiàn)象,而懷孕期間母體Hcy濃度輕度升高或蛋氨酸濃度輕度降低將會(huì)干擾神經(jīng)管閉合。導(dǎo)致Hcy在血中貯積的關(guān)鍵酶主要有三個(gè):首先是N5甲基四氫葉酸半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,此酶可催化Hcy甲基化變成蛋氨酸,但是它與NTD的關(guān)系未見報(bào)道。第二個(gè)關(guān)鍵酶是胱硫醚β?合成酶(CBS),它可催化Hcy與絲氨酸合成胱硫醚以減少Hcy的蓄積。Ramsboottcm等研究了一個(gè)嚴(yán)重影響CBS功能的突變C307S在正常群體和NTD群體中的出現(xiàn)頻率,結(jié)果他發(fā)現(xiàn)二者間無任何差別,因此他認(rèn)為CBS等位基因的功能喪失與NTD無關(guān)。第三個(gè)關(guān)鍵酶就是N5,N10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR),它在半胱氨酸的代謝中有非常重要的地位,它催化N5,N10亞甲基四氫葉酸還原成N5甲基四氫葉酸,而后者將甲基轉(zhuǎn)給Hcy使其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷必將導(dǎo)致Hcy向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化發(fā)生障礙。自從1994年Goyette等成功地將MTHFR的cDNA分離出來后,對(duì)MTHFR的研究進(jìn)一步深入。人們發(fā)現(xiàn)人群中MTHFR基因內(nèi)存在一個(gè)多態(tài)位點(diǎn),即677C→T的改變,由于該突變會(huì)造成此酶活性下降及耐熱性降低而導(dǎo)致葉酸代謝紊亂,被第一個(gè)認(rèn)為是NTD的遺傳危險(xiǎn)因素。Ou等人及Whitehead等人的研究都認(rèn)為MTHFR基因677C→T多態(tài)是NTD的一個(gè)危險(xiǎn)因素。本研究在選擇了匹配的對(duì)照組,并排除種族,地區(qū)的影響的情況下,通過對(duì)24位生過正常孩子的母親和27位生過NTD患兒的母親的MTHFRC677T突變情況進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):母親的正常對(duì)照組中的V/V基因型頻率為12.5%,而NT